Способ выделения и активации консорциума аборигенных микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов. Аборигенная микрофлора нефти


Способ выделения и активации консорциума аборигенных микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов

Изобретение относится к биотехнологии. Способ включает отбор проб с нефтезагрязненных почв и грунтов, выделение консорциума аборигенных нефтеокисляющих микроорганизмов, причем после выделения проводят активацию консорциума аборигенных нефтеокисляющих микроорганизмов с использованием смеси биотрина с отходом спиртового производства - барды, при соотношении компонентов 1:1 в количестве не менее 0,01 мас.%. Изобретение позволяет сократить продолжительность выделения аборигенных нефтеокисляющих микроорганизмов-деструкторов, упростить технологию наработки биомассы штаммов-деструкторов. 6 ил., 4 табл.

 

Изобретение относится к области охраны окружающей среды и может быть использовано при восстановлении нефтезагрязненных земель.

Способ включает отбор проб с нефтезагрязненной почв и грунтов, выделение ассоциации активных аборигенных штаммов-деструкторов нефти и нефтепродуктов, активацию полученной ассоциации и дальнейшую наработку биомассы ассоциации в ферментерах при оптимальных параметрах культивирования. Способ повышает вероятность поиска наиболее активных представителей углеводородокисляющих микроорганизмов для очистки конкретного участка нефтезагрязненных земель, позволяет сократить затраты на производство и транспортировку биопрепаратов.

Известно, что в почве и грунте, особенно загрязненной нефтью и нефтепродуктами, содержатся аэробные штаммы, способные биотрансформировать нефть и нефтепродукты. Среди них часто встречаются микроорганизмы родов Arthrobacter, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus и др.

Известно использование биопрепаратов на основе активных штаммов-деструкторов нефти и нефтепродуктов [А.с. СССР №1076446, кл. C12N 15/09, 1978, патент РФ №2019527, кл. C02F 3/34, E02B 15/04, 1993, патент РФ №2142996, кл. C12N 1/26, C02F 3/34, В09С 1/10, 1999]. Недостатками этих способов являются продолжительность времени, необходимого на наработку биопрепарата, высокая стоимость и низкая эффективность.

Известен способ выделения деструкторов нефти и нефтепродуктов из числа аборигенных штаммов микроорганизмов [Патент РФ №2241745. Способ выделения деструкторов нефти и нефтепродуктов. Сатубалдин К.К., Салангинас Л.А.]. (прототип). Суть способа: производится отбор проб с нефтезагрязненной поверхности, затем проводится селекция углеводородокисляющих бактерий с последующим пересевом полученных культур и наработка в отдельности всех отселектированных микроорганизмов в ферментерах при параметрах культивирования, оптимальных для выделенных микроорганизмов. Недостатком известного способа является продолжительность выделения аборигенных нефтеокисляющих микроорганизмов, связанная с селекцией штаммов-деструкторов, а также сложность наработки бактериального препарата на их основе (требуется сложное аппаратурное оформление). Кроме того, не предусмотрена предварительная активация ассоциации нефтеокисляющих штаммов-деструкторов.

Задачей данного изобретения является сокращение продолжительности выделения аборигенных нефтеокисляющих микроорганизмов-деструкторов, упрощение технологии наработки биомассы штаммов-деструкторов.

Суть способа: производится отбор проб с нефтезагрязненных почвы и грунтов и выделение углеводородокисляющих микроорганизмов из образца конкретного участка нефтезагрязненной земли. Далее проводится активация полученной ассоциации с использованием смеси биодобавок биотрина и спиртовой барды, взятых в соотношении 1:1 в качестве фактора роста.

Известно, что информация на деструкцию нефти и нефтепродуктов в основном закодирована в плазмидах бактериальных клеток [Ягафарова Г.Г. Разработка биотехнологии очистки почвы и воды от некоторых хлорфенольных соединений и углеводородов нефти: Дис. на соискание уч. ст. д-ра технических наук. - Уфа, 1994]. Учитывая, что в число ассоциации аборигенных микроорганизмов будут входить как психрофильные, так мезафильные и термофильные микроорганизмы, селекция микроорганизмов не проводилась, а наработка биомассы осуществлялась при 25-30°С.

Способ осуществляется следующим образом.

На первом этапе работ проводится отбор образцов нефтезагрязненных почв и грунтов, выделение микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов из числа диких штаммов.

Основные операции по отбору проб осуществляются согласно ГОСТ 17.4.3.01-83 «Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб».

Для выделения микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов используют жидкую питательную среду Маккланга следующего состава: NaNO3 - 2,0 г/л; КН2PO4 - 1,0 г/л; MnSO4 - 0,013 г/л; MgSO4·7h3O - 0,5 г/л; ZnSO4 - 0,002 г/л; Fe2(SO4)3 - 0,001 г/л. Среду стерилизуют при 110°С в течение 30 мин.

Один грамм пробы почвы переносится в стерильную фарфоровую ступку, слегка увлажняется стерильной солевой средой и растирается до пастообразного состояния. Содержимое переносится в колбу на 250 мл (ступку и пестик ополоснуть солевой средой, перенося остаток в ту же колбу). Общий объем смеси доводится до 100 мл.

В качестве единственного источника углерода и энергии добавляют стерильный гексадекан (1 мас.%).

Культивирование проводят в качалочных колбах на термостатированной качалке при температуре 30°С и частоте вращения 100 мин-1 в течение 3 суток. Через трое суток отмечают видимые изменения в системе жидкой фазы - помутнение среды, появление пигмента, расслоение, изменение цвета и др.

Анализ состава накопительной культуры различных физиологических групп микроорганизмов производят путем высева определенных объемов воды на агаризованную среду по методу Коха.

На следующем этапе проводится активация нефтеокисляющих штаммов с помощью биогенных и минеральных добавок.

Активация проводится в жидкой минеральной среде Маккланга. Единственным источником углерода и энергии является нефть и/или нефтепродукты (гексадекан, дизельное топливо, мазут).

Для биологической стимуляции роста микроорганизмов и в качестве фактора роста используется смесь биодобавок: биотрин (ТУ 9291-001-00479994-95) и отход спиртового производства - барда, в соотношении 1:1 в количестве не менее 0,01 мас.%

Биотрин представляет собой сухой продукт, полученный микробиологическим синтезом из углеводородсодержащего сырья. Биотрин является эффективной балансирующей добавкой. Биотрин содержит в своем составе до 40-42% сырого протеина. В биотрине имеется 17 важнейших аминокислот, в том числе незаменимых, а также широкий спектр витаминов, макро- и микроэлементов. Биотрин является экологически чистым продуктом, не содержит токсических элементов.

Отход спиртового производства, барда - имеет в достаточном количестве легко растворимые азотистые соединения и полезные вещества: протеин (20-22%), жир (5-7%), клетчатках (13-18%), зола (7-8%), комплекс микроэлементов (кобальт, марганец, ванадий, железо и др.).

Процесс активации ассоциации штаммов-деструкторов проводят при температуре t=25-30°С и рН 7. Необходимо периодическое перемешивание.

На третьем этапе проводится наращивание необходимого количества биомассы полученной ассоциаци.

Глубинное культивирование ассоциации аборигенных микроорганизмов проводят в биореакторе, снабженном компрессором и мешалкой (например, 114.207.012.01.00.00 Ферментатор объемом 1 м3, материал 12Х18Н10Т ГОСТ 5632-73 с перемешивающим устройством). Поддерживают заданную температуру, рН, pO2. Культивирование проводят в полной минеральной среде Маккланга. В качестве источника углерода используют жидкие парафины, а при их отсутствии дизельное топливо или сырую нефть не менее 1 мас.% Процесс проводится при температуре t=25-30°С и рН 7 в течение 1-3 суток до достижения биомассы 0,3-0,5 мас.% При этом численность нефтеокисляющих микроорганизмов в готовой суспензии должна составлять не менее 109 клеток/мл. В процессе культивирования контролируют температуру ведения ферментации, накопление биомассы (методом КОЕ на 12 час культивирования и далее через каждые 6 часов), микрокопирование препарата ферментационной жидкости, рН.

По окончании процесса культивирования наработанную суспензию сливают в емкости и используют в качестве биопрепарата для обработки нефтезагрязненных объектов.

На 1 м2 нефтезагрязненных земель (содержание нефти до 13 мас.%) используют 1-1,5 л полученной суспензии аборигенных микроорганизмов. Для очистки нефтезагрязненных вод от нефти и нефтепродуктов суспензию ассоциации штаммов-деструкторов добавляют в биореактор для очистки сточной воды в количестве 3-5 об.%

Пример 1

С целью изучения процесса выделения аборигенных микроорганизмов из образцов нефтезагрязненных земель: Полигон Северный (Волжский р-н, п.Водино) - образец №1 (общее содержание нетфи и нефтепродуктов 3 мас.%), Дружба-1 (Безенчукский р-н, 37-й км) - образец №2 (общее содержание нетфи и нефтепродуктов 5 мас.%) или ЛПДС Самара (п.Просвет) - образец №3 (общее содержание нетфи и нефтепродуктов 10 мас.%) были проведены эксперименты в стерильной жидкой минеральной среде Маккланга.

В качестве факторов роста в первой серии опытов добавляли биотрин в количестве 0,01 мас.%, во второй серии опытов добавляли спиртовую барду в количестве 0,01 мас.%, в третьей серии опытов добавляли смесь биодобавок (биотрин:барда = 1:1) в количестве 0,01 мас.%. В качестве единственного источника углерода и энергии добавляли стерильный гексадекан в количестве 1 мас.%. В опытные колбы №1, №2 и №3 вносили по 1 г образцов техногеннозагрязненных земель №1, №2 и №3 соответственно. Для сравнения ставили аналогичные опыты без добавления биодобавок.

Культивирование проводили в качалочных колбах на термостатированной качалке при температуре 30°С и частоте вращения 100 мин-1.

О нефтеокисляющей способности аборигенной микрофлоры судили по уменьшению содержания гексадекана, приросту численности микроорганизмов и изменению рН среды.

Содержание гексадекана определяли спектрофотометрически на приборе UR-20 при 1460 см-1, предварительно экстрагируя его четыреххлористым углеродом.

Изменение рН культуральной жидкости определяли путем замера рН с помощью иономера И-130,2 М в начале и конце культивирования.

Численность микроорганизмов определяли чашечным методом Коха при высеве на агаризованную среду для гетеротрофных микроорганизмов (мясопептонный агар).

Результаты исследований представлены на фигурах 1-2 и таблице 1. После 3 суток культивирования в опытных колбах №1, 2 и 3 с добавлением биотрина и с добавлением барды наблюдалось помутнение культуральной жидкости и появление пленки.

Как видно из фигуры 1, во всех опытных колбах с биотрином и бардой наблюдалось увеличение общего количества микроорганизмов и изменение рН среды в сторону подщелачивания (таблица 1). При этом наибольший прирост микроорганизмов наблюдался в серии опытов со смесью биодобавок биотрин:барда.

Содержание гексадекана снизилось в среднем до 0,1 мас.% сериях опытов с одной биодобавкой и до 0,07 мас.% в серии опытов со смесью биодобавок (фигура 2). В контрольных колбах изменений содержания гексадекана, количества микроорганизмов и рН среды не наблюдалось.

В опытных колбах без биодобавок незначительный прирост количества микроорганизмов наблюдался лишь на 3 сутки, содержание гексадекана снизилось незначительно (до 0,7-0,9 мас.%).

Таким образом, биотрин и спиртовая барда являются активными стимуляторами роста аборигеных нефтеокисляющих микроорганизмов.

Пример 2

Для установления оптимальной концентрации смеси биодобавок биотрин:барда для активации аборигенных микроорганизмов ставили следующий опыт. В жидкую минеральную среду Маккланга добавляли стерильную нефть конкретного месторождения (Самарская обл.) в количестве 1 мас.% и различные количества смеси биодобавок (биотрин:барда = 1:1): 0,01, 0,03, 0,05, 0,10 мас.%. Для биодеградации нефти вводили суспензию ассоциации аборигенных микроорганизмов, полученную в примере 1 (образец №1) в количестве 3 об.%. Контролем служила колба без добавления биодобавок.

О биодеградации нефти судили по уменьшению ее количества, которое определяли спектрофотометрически на приборе UR-20 при 2923 см-1, предварительно экстрагируя ее четыреххлористым углеродом.

Как видно из результатов приведенных в таблице 2, степень биодеградации уже при содержании биодобавок 0,01 мас.% на 10% выше, чем без добавления биодобавок.

Таким образом, концентрация смеси биодобавок биотрина и барды в соотношении 1:1, равная 0,01 мас.%, уже достаточна для активации аборигенных микроорганизмов.

Пример 3

Для изучения процессов биодеградации нефти и нефтепродуктов были проведены эксперименты в жидкой минеральной среде Маккланга (стерильной). В качестве единственного источника углерода и энергии добавляли нефть конкретного месторождения (Самарская обл.), в количестве 1 мас.%. Для биодеградации нефти в среду вносили суспензию ассоциации активированных аборигенных микроорганизмов из нефтезагрязненных образцов (№1, №2 или №3) почв в количестве 3 об.%.

В качестве факторов роста добавляли смесь биодобавок биотрина и барды в соотношении 1:1 в количестве 0,01 мас.%. Культивирование проводили в качалочных колбах на термостатированной качалке при температуре 30°С и частоте вращения 100 мин-1. Для сравнения ставили аналогичные опыты без добавления биодобавок. Колбы с минеральной средой Маккланга, содержащие 1 мас.% нефти, но не инокулированные микроорганизмами, служили контролем.

О степени биодеградации нефти судили по уменьшению ее количества, а также косвенно по приросту численности бактерий и изменению рН среды.

Результаты исследований представлены на рисунках 1-3 и таблице 1.

Как видно из фигуры 3, биодеградация нефти произошла более чем на 90% во всех опытах с использованием активированной микрофлорой, в то время как в контрольных колбах естественная убыль нефти не превышала 5%.

При этом во всех опытных колбах наблюдалось увеличение общего количества микроорганизмов (фигура 4) и изменение рН среды в сторону подщелачивания (таблица 3). В контрольных колбах никаких изменений не наблюдалось.

Пример 4.

С целью исследования процесса биоразложения легких и тяжелых фракций углеводородов при помощи аборигенной микрофлоры с добавлением смеси биодобавок биотрина и барды в соотношении 1:1 были проведены эксперименты.

Для этого в серии опытов аборигенные штаммы микроорганизмов культивировали в стерильной минеральной среде со смесью биодобавок биотрина и барды в соотношении 1:1 (0,01 мас.%) с добавлением в качестве единственного источника углерода: гексадекан, дизельное топливо, нефть и мазут конкретного месторождения (Самарская обл.) в количестве 1 мас.%. Колбы без добавления биодобавок служили контролем.

Минеральную среду Маккланга (состав приведен выше) разливали по 50 мл в качалочные колбы объемом 250 мл и стерилизовали при 1 атм. 30 мин. Засевали из расчета 3% по объему суспензии аборигенных микроорганизмов. В качестве единственного источника углерода добавляли гексадекан, дизельное топливо, нефть или мазут в количестве 1 мас.%.

Условия культивирования описаны выше.

О биоразложении нефти и нефтепродуктов судили путем количественного анализа на спектрофотометре UR-20 при 2923 см-1 (нефти, дизельное топливо, мазут) и при 1460 см-1 (гексадекан). Предварительно нефть и нефтепродукты экстрагировали четыреххлористым углеродом

На фигуре 5 представлены результаты изучения зависимости биодеградации гексадекана, дизельного топлива, нефти, мазута в воде через 48 часов.

Из приведенных данных таблицы 4 и фигуры 5 видно, что аборигенные микроорганизмы способны использовать не только легкие фракции нефти, такие как гексадекан, но и дизельное топливо и более тяжелые фракции нефти, как мазут, т.е. разлагать широкий спектр углеводородов. Причем степень биодеградации при добавлении смеси биодобавок биотрин и барда в соотношении 1:1 в качестве стимулятора роста увеличивает степень биодеградации нефти и нефтепродуктов в среднем на 20%. Так в опытах с добавлением смеси биодобавок степень биодеградации гексадекана составила 99%, дизельного топлива 85%, нефти - 84%, мазута - 65%. В опытах без добавления биодобавок степень биодеградации составила 61; 52,8; 48,2 и 32,7% соответственно.

Пример 5

С целью определения окислительной способности аборигенной микрофлоры образцов почвы и в нефтезагрязненной почве с заданных участков исследовали 3 образца нефтезагрязненных почв и грунтов:

1. Полигон Северный (Волжский р-н, п.Водино) - образец №1.

Общее содержание нефти и нефтепродуктов 3 мас.%.

2. Дружба-1 (Безенчукский р-н, 37-й км) - образец №2.

Общее содержание нефти и нефтепродуктов 5 мас.%.

3. ЛПДС Самара (п.Просвет) - образец №3.

Общее содержание нефти и нефтепродуктов 10 мас.%.

Исследования проводили в фарфоровых чашках объемом 100 мл. В первой серии опытов 50 мг загрязненных образцов почвы обрабатывали суспензией аборигенных микроорганизмов (3 об.%), взятых с этого же образца и смесью биодобавок биотрина и барды взятых в соотношении 1:1 (0,01 мас.%). Во второй серии опытов не добавляли биодобавки. Контролем служили чашки без внесения микроорганизмов.

Очистку почвы проводили при комнатной температуре в течение 90 суток. Влажность почвы поддерживали 60% от полной влагоемкости.

О степени биодеградации нефти судили по ее остаточному количеству в почве.

Результаты исследований представлены на фигуре 6.

Как видно из результатов, приведенных на фигуре 6, активированная ассоциация аборигенной микрофлоры способна деградировать нефть и нефтепродукты в почве и грунте. Причем при обработке почвы смесью биодобавок биотрина и барды, взятых в соотношении 1:1, степень биодеградации заметно возрастает. Так для образцов почвы №1, 2 и 3 она составила 80, 75 и 64% соответственно. Без обработки биодобавками - 60, 57 и 42%.

Таблица 1Результаты измерения рН в опытных и контрольных колбах
Название опыта Начальное Через 3 суток
Образец №1 с биотрином 6,2 7,2
Образец №1 с бардой 6,2 7,2
Образец №1 без биодобавок 6,2 6,8
Образец №2 с биотрином 6,2 7,1
Образец №2 с бардой 6,2 7,0
Образец №2 без биодобавок 6,2 6,9
Образец №3 с биотрином 6,2 7,1
Образец №3 с бардой 6,2 7,1
Образец №3 без биодобавок 6,2 6,9
Контроль 6,2 6,2
Таблица 2Влияние количества смеси биодобавок на степень биодеградании нефти
Концентрация биодобавок, % 0 0,01 0,03 0,05 0,08 0,10
Степень биодеградации нефти, % 68 78 84 91 91 91
Таблица 3
Название опыта Начальное Через 3 суток
Образец №1 с биодобавками 6,2 7,0
Образец №1 без биодобавок 6,2 6,8
Образец №2 с биодобавками 6,2 7,1
Образец №2 без биодобавок 6,2 6,7
Образец №3 с биодобавками 6,2 7,1
Образец №3 без биодобавок 6,2 6,8
Контроль с биодобавками 6,2 6,2
Контроль без биодобавок 6,2 6,2
Таблица 4Динамика роста микроорганизмов в среде с углеводородами с добавлением смеси биодобавок
Вариант Количество микроорганизмов, растущих на МПА, кл/мл, час
0 24 36 48
1. Гексадекан 1·105 8·107 5·108 1·109
2. Диз. топливо 1·105 9·107 7·108 9·108
3. Нефть 1·105 8·107 3·108 5·108
4. Мазут 1·105 9·106 2·107 4·107

Способ выделения и активации консорциума аборигенных нефтеокисляющих микроорганизмов, включающий отбор проб с нефтезагрязненных почв и грунтов, выделение консорциума аборигенных нефтеокисляющих микроорганизмов, отличающийся тем, что после выделения проводят активацию консорциума аборигенных нефтеокисляющих микроорганизмов с использованием смеси биотрина с отходом спиртового производства - барды при соотношении компонентов 1:1 в количестве не менее 0,01 мас.%.

www.findpatent.ru

способ выделения и активации консорциума аборигенных микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов - патент РФ 2352630

Изобретение относится к биотехнологии. Способ включает отбор проб с нефтезагрязненных почв и грунтов, выделение консорциума аборигенных нефтеокисляющих микроорганизмов, причем после выделения проводят активацию консорциума аборигенных нефтеокисляющих микроорганизмов с использованием смеси биотрина с отходом спиртового производства - барды, при соотношении компонентов 1:1 в количестве не менее 0,01 мас.%. Изобретение позволяет сократить продолжительность выделения аборигенных нефтеокисляющих микроорганизмов-деструкторов, упростить технологию наработки биомассы штаммов-деструкторов. 6 ил., 4 табл.

Изобретение относится к области охраны окружающей среды и может быть использовано при восстановлении нефтезагрязненных земель.

Способ включает отбор проб с нефтезагрязненной почв и грунтов, выделение ассоциации активных аборигенных штаммов-деструкторов нефти и нефтепродуктов, активацию полученной ассоциации и дальнейшую наработку биомассы ассоциации в ферментерах при оптимальных параметрах культивирования. Способ повышает вероятность поиска наиболее активных представителей углеводородокисляющих микроорганизмов для очистки конкретного участка нефтезагрязненных земель, позволяет сократить затраты на производство и транспортировку биопрепаратов.

Известно, что в почве и грунте, особенно загрязненной нефтью и нефтепродуктами, содержатся аэробные штаммы, способные биотрансформировать нефть и нефтепродукты. Среди них часто встречаются микроорганизмы родов Arthrobacter, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus и др.

Известно использование биопрепаратов на основе активных штаммов-деструкторов нефти и нефтепродуктов [А.с. СССР № 1076446, кл. C12N 15/09, 1978, патент РФ № 2019527, кл. C02F 3/34, E02B 15/04, 1993, патент РФ № 2142996, кл. C12N 1/26, C02F 3/34, В09С 1/10, 1999]. Недостатками этих способов являются продолжительность времени, необходимого на наработку биопрепарата, высокая стоимость и низкая эффективность.

Известен способ выделения деструкторов нефти и нефтепродуктов из числа аборигенных штаммов микроорганизмов [Патент РФ № 2241745. Способ выделения деструкторов нефти и нефтепродуктов. Сатубалдин К.К., Салангинас Л.А.]. (прототип). Суть способа: производится отбор проб с нефтезагрязненной поверхности, затем проводится селекция углеводородокисляющих бактерий с последующим пересевом полученных культур и наработка в отдельности всех отселектированных микроорганизмов в ферментерах при параметрах культивирования, оптимальных для выделенных микроорганизмов. Недостатком известного способа является продолжительность выделения аборигенных нефтеокисляющих микроорганизмов, связанная с селекцией штаммов-деструкторов, а также сложность наработки бактериального препарата на их основе (требуется сложное аппаратурное оформление). Кроме того, не предусмотрена предварительная активация ассоциации нефтеокисляющих штаммов-деструкторов.

Задачей данного изобретения является сокращение продолжительности выделения аборигенных нефтеокисляющих микроорганизмов-деструкторов, упрощение технологии наработки биомассы штаммов-деструкторов.

Суть способа: производится отбор проб с нефтезагрязненных почвы и грунтов и выделение углеводородокисляющих микроорганизмов из образца конкретного участка нефтезагрязненной земли. Далее проводится активация полученной ассоциации с использованием смеси биодобавок биотрина и спиртовой барды, взятых в соотношении 1:1 в качестве фактора роста.

Известно, что информация на деструкцию нефти и нефтепродуктов в основном закодирована в плазмидах бактериальных клеток [Ягафарова Г.Г. Разработка биотехнологии очистки почвы и воды от некоторых хлорфенольных соединений и углеводородов нефти: Дис. на соискание уч. ст. д-ра технических наук. - Уфа, 1994]. Учитывая, что в число ассоциации аборигенных микроорганизмов будут входить как психрофильные, так мезафильные и термофильные микроорганизмы, селекция микроорганизмов не проводилась, а наработка биомассы осуществлялась при 25-30°С.

Способ осуществляется следующим образом.

На первом этапе работ проводится отбор образцов нефтезагрязненных почв и грунтов, выделение микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов из числа диких штаммов.

Основные операции по отбору проб осуществляются согласно ГОСТ 17.4.3.01-83 «Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб».

Для выделения микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов используют жидкую питательную среду Маккланга следующего состава: NaNO3 - 2,0 г/л; КН2PO4 - 1,0 г/л; MnSO4 - 0,013 г/л; MgSO4·7H 2O - 0,5 г/л; ZnSO4 - 0,002 г/л; Fe2 (SO4)3 - 0,001 г/л. Среду стерилизуют при 110°С в течение 30 мин.

Один грамм пробы почвы переносится в стерильную фарфоровую ступку, слегка увлажняется стерильной солевой средой и растирается до пастообразного состояния. Содержимое переносится в колбу на 250 мл (ступку и пестик ополоснуть солевой средой, перенося остаток в ту же колбу). Общий объем смеси доводится до 100 мл.

В качестве единственного источника углерода и энергии добавляют стерильный гексадекан (1 мас.%).

Культивирование проводят в качалочных колбах на термостатированной качалке при температуре 30°С и частоте вращения 100 мин-1 в течение 3 суток. Через трое суток отмечают видимые изменения в системе жидкой фазы - помутнение среды, появление пигмента, расслоение, изменение цвета и др.

Анализ состава накопительной культуры различных физиологических групп микроорганизмов производят путем высева определенных объемов воды на агаризованную среду по методу Коха.

На следующем этапе проводится активация нефтеокисляющих штаммов с помощью биогенных и минеральных добавок.

Активация проводится в жидкой минеральной среде Маккланга. Единственным источником углерода и энергии является нефть и/или нефтепродукты (гексадекан, дизельное топливо, мазут).

Для биологической стимуляции роста микроорганизмов и в качестве фактора роста используется смесь биодобавок: биотрин (ТУ 9291-001-00479994-95) и отход спиртового производства - барда, в соотношении 1:1 в количестве не менее 0,01 мас.%

Биотрин представляет собой сухой продукт, полученный микробиологическим синтезом из углеводородсодержащего сырья. Биотрин является эффективной балансирующей добавкой. Биотрин содержит в своем составе до 40-42% сырого протеина. В биотрине имеется 17 важнейших аминокислот, в том числе незаменимых, а также широкий спектр витаминов, макро- и микроэлементов. Биотрин является экологически чистым продуктом, не содержит токсических элементов.

Отход спиртового производства, барда - имеет в достаточном количестве легко растворимые азотистые соединения и полезные вещества: протеин (20-22%), жир (5-7%), клетчатках (13-18%), зола (7-8%), комплекс микроэлементов (кобальт, марганец, ванадий, железо и др.).

Процесс активации ассоциации штаммов-деструкторов проводят при температуре t=25-30°С и рН 7. Необходимо периодическое перемешивание.

На третьем этапе проводится наращивание необходимого количества биомассы полученной ассоциаци.

Глубинное культивирование ассоциации аборигенных микроорганизмов проводят в биореакторе, снабженном компрессором и мешалкой (например, 114.207.012.01.00.00 Ферментатор объемом 1 м3, материал 12Х18Н10Т ГОСТ 5632-73 с перемешивающим устройством). Поддерживают заданную температуру, рН, pO2. Культивирование проводят в полной минеральной среде Маккланга. В качестве источника углерода используют жидкие парафины, а при их отсутствии дизельное топливо или сырую нефть не менее 1 мас.% Процесс проводится при температуре t=25-30°С и рН 7 в течение 1-3 суток до достижения биомассы 0,3-0,5 мас.% При этом численность нефтеокисляющих микроорганизмов в готовой суспензии должна составлять не менее 109 клеток/мл. В процессе культивирования контролируют температуру ведения ферментации, накопление биомассы (методом КОЕ на 12 час культивирования и далее через каждые 6 часов), микрокопирование препарата ферментационной жидкости, рН.

По окончании процесса культивирования наработанную суспензию сливают в емкости и используют в качестве биопрепарата для обработки нефтезагрязненных объектов.

На 1 м2 нефтезагрязненных земель (содержание нефти до 13 мас.%) используют 1-1,5 л полученной суспензии аборигенных микроорганизмов. Для очистки нефтезагрязненных вод от нефти и нефтепродуктов суспензию ассоциации штаммов-деструкторов добавляют в биореактор для очистки сточной воды в количестве 3-5 об.%

Пример 1

С целью изучения процесса выделения аборигенных микроорганизмов из образцов нефтезагрязненных земель: Полигон Северный (Волжский р-н, п.Водино) - образец № 1 (общее содержание нетфи и нефтепродуктов 3 мас.%), Дружба-1 (Безенчукский р-н, 37-й км) - образец № 2 (общее содержание нетфи и нефтепродуктов 5 мас.%) или ЛПДС Самара (п.Просвет) - образец № 3 (общее содержание нетфи и нефтепродуктов 10 мас.%) были проведены эксперименты в стерильной жидкой минеральной среде Маккланга.

В качестве факторов роста в первой серии опытов добавляли биотрин в количестве 0,01 мас.%, во второй серии опытов добавляли спиртовую барду в количестве 0,01 мас.%, в третьей серии опытов добавляли смесь биодобавок (биотрин:барда = 1:1) в количестве 0,01 мас.%. В качестве единственного источника углерода и энергии добавляли стерильный гексадекан в количестве 1 мас.%. В опытные колбы № 1, № 2 и № 3 вносили по 1 г образцов техногеннозагрязненных земель № 1, № 2 и № 3 соответственно. Для сравнения ставили аналогичные опыты без добавления биодобавок.

Культивирование проводили в качалочных колбах на термостатированной качалке при температуре 30°С и частоте вращения 100 мин-1.

О нефтеокисляющей способности аборигенной микрофлоры судили по уменьшению содержания гексадекана, приросту численности микроорганизмов и изменению рН среды.

Содержание гексадекана определяли спектрофотометрически на приборе UR-20 при 1460 см-1 , предварительно экстрагируя его четыреххлористым углеродом.

Изменение рН культуральной жидкости определяли путем замера рН с помощью иономера И-130,2 М в начале и конце культивирования.

Численность микроорганизмов определяли чашечным методом Коха при высеве на агаризованную среду для гетеротрофных микроорганизмов (мясопептонный агар).

Результаты исследований представлены на фигурах 1-2 и таблице 1. После 3 суток культивирования в опытных колбах № 1, 2 и 3 с добавлением биотрина и с добавлением барды наблюдалось помутнение культуральной жидкости и появление пленки.

Как видно из фигуры 1, во всех опытных колбах с биотрином и бардой наблюдалось увеличение общего количества микроорганизмов и изменение рН среды в сторону подщелачивания (таблица 1). При этом наибольший прирост микроорганизмов наблюдался в серии опытов со смесью биодобавок биотрин:барда.

Содержание гексадекана снизилось в среднем до 0,1 мас.% сериях опытов с одной биодобавкой и до 0,07 мас.% в серии опытов со смесью биодобавок (фигура 2). В контрольных колбах изменений содержания гексадекана, количества микроорганизмов и рН среды не наблюдалось.

В опытных колбах без биодобавок незначительный прирост количества микроорганизмов наблюдался лишь на 3 сутки, содержание гексадекана снизилось незначительно (до 0,7-0,9 мас.%).

Таким образом, биотрин и спиртовая барда являются активными стимуляторами роста аборигеных нефтеокисляющих микроорганизмов.

Пример 2

Для установления оптимальной концентрации смеси биодобавок биотрин:барда для активации аборигенных микроорганизмов ставили следующий опыт. В жидкую минеральную среду Маккланга добавляли стерильную нефть конкретного месторождения (Самарская обл.) в количестве 1 мас.% и различные количества смеси биодобавок (биотрин:барда = 1:1): 0,01, 0,03, 0,05, 0,10 мас.%. Для биодеградации нефти вводили суспензию ассоциации аборигенных микроорганизмов, полученную в примере 1 (образец № 1) в количестве 3 об.%. Контролем служила колба без добавления биодобавок.

О биодеградации нефти судили по уменьшению ее количества, которое определяли спектрофотометрически на приборе UR-20 при 2923 см-1, предварительно экстрагируя ее четыреххлористым углеродом.

Как видно из результатов приведенных в таблице 2, степень биодеградации уже при содержании биодобавок 0,01 мас.% на 10% выше, чем без добавления биодобавок.

Таким образом, концентрация смеси биодобавок биотрина и барды в соотношении 1:1, равная 0,01 мас.%, уже достаточна для активации аборигенных микроорганизмов.

Пример 3

Для изучения процессов биодеградации нефти и нефтепродуктов были проведены эксперименты в жидкой минеральной среде Маккланга (стерильной). В качестве единственного источника углерода и энергии добавляли нефть конкретного месторождения (Самарская обл.), в количестве 1 мас.%. Для биодеградации нефти в среду вносили суспензию ассоциации активированных аборигенных микроорганизмов из нефтезагрязненных образцов ( № 1, № 2 или № 3) почв в количестве 3 об.%.

В качестве факторов роста добавляли смесь биодобавок биотрина и барды в соотношении 1:1 в количестве 0,01 мас.%. Культивирование проводили в качалочных колбах на термостатированной качалке при температуре 30°С и частоте вращения 100 мин-1. Для сравнения ставили аналогичные опыты без добавления биодобавок. Колбы с минеральной средой Маккланга, содержащие 1 мас.% нефти, но не инокулированные микроорганизмами, служили контролем.

О степени биодеградации нефти судили по уменьшению ее количества, а также косвенно по приросту численности бактерий и изменению рН среды.

Результаты исследований представлены на рисунках 1-3 и таблице 1.

Как видно из фигуры 3, биодеградация нефти произошла более чем на 90% во всех опытах с использованием активированной микрофлорой, в то время как в контрольных колбах естественная убыль нефти не превышала 5%.

При этом во всех опытных колбах наблюдалось увеличение общего количества микроорганизмов (фигура 4) и изменение рН среды в сторону подщелачивания (таблица 3). В контрольных колбах никаких изменений не наблюдалось.

Пример 4.

С целью исследования процесса биоразложения легких и тяжелых фракций углеводородов при помощи аборигенной микрофлоры с добавлением смеси биодобавок биотрина и барды в соотношении 1:1 были проведены эксперименты.

Для этого в серии опытов аборигенные штаммы микроорганизмов культивировали в стерильной минеральной среде со смесью биодобавок биотрина и барды в соотношении 1:1 (0,01 мас.%) с добавлением в качестве единственного источника углерода: гексадекан, дизельное топливо, нефть и мазут конкретного месторождения (Самарская обл.) в количестве 1 мас.%. Колбы без добавления биодобавок служили контролем.

Минеральную среду Маккланга (состав приведен выше) разливали по 50 мл в качалочные колбы объемом 250 мл и стерилизовали при 1 атм. 30 мин. Засевали из расчета 3% по объему суспензии аборигенных микроорганизмов. В качестве единственного источника углерода добавляли гексадекан, дизельное топливо, нефть или мазут в количестве 1 мас.%.

Условия культивирования описаны выше.

О биоразложении нефти и нефтепродуктов судили путем количественного анализа на спектрофотометре UR-20 при 2923 см-1 (нефти, дизельное топливо, мазут) и при 1460 см-1 (гексадекан). Предварительно нефть и нефтепродукты экстрагировали четыреххлористым углеродом

На фигуре 5 представлены результаты изучения зависимости биодеградации гексадекана, дизельного топлива, нефти, мазута в воде через 48 часов.

Из приведенных данных таблицы 4 и фигуры 5 видно, что аборигенные микроорганизмы способны использовать не только легкие фракции нефти, такие как гексадекан, но и дизельное топливо и более тяжелые фракции нефти, как мазут, т.е. разлагать широкий спектр углеводородов. Причем степень биодеградации при добавлении смеси биодобавок биотрин и барда в соотношении 1:1 в качестве стимулятора роста увеличивает степень биодеградации нефти и нефтепродуктов в среднем на 20%. Так в опытах с добавлением смеси биодобавок степень биодеградации гексадекана составила 99%, дизельного топлива 85%, нефти - 84%, мазута - 65%. В опытах без добавления биодобавок степень биодеградации составила 61; 52,8; 48,2 и 32,7% соответственно.

Пример 5

С целью определения окислительной способности аборигенной микрофлоры образцов почвы и в нефтезагрязненной почве с заданных участков исследовали 3 образца нефтезагрязненных почв и грунтов:

1. Полигон Северный (Волжский р-н, п.Водино) - образец № 1.

Общее содержание нефти и нефтепродуктов 3 мас.%.

2. Дружба-1 (Безенчукский р-н, 37-й км) - образец № 2.

Общее содержание нефти и нефтепродуктов 5 мас.%.

3. ЛПДС Самара (п.Просвет) - образец № 3.

Общее содержание нефти и нефтепродуктов 10 мас.%.

Исследования проводили в фарфоровых чашках объемом 100 мл. В первой серии опытов 50 мг загрязненных образцов почвы обрабатывали суспензией аборигенных микроорганизмов (3 об.%), взятых с этого же образца и смесью биодобавок биотрина и барды взятых в соотношении 1:1 (0,01 мас.%). Во второй серии опытов не добавляли биодобавки. Контролем служили чашки без внесения микроорганизмов.

Очистку почвы проводили при комнатной температуре в течение 90 суток. Влажность почвы поддерживали 60% от полной влагоемкости.

О степени биодеградации нефти судили по ее остаточному количеству в почве.

Результаты исследований представлены на фигуре 6.

Как видно из результатов, приведенных на фигуре 6, активированная ассоциация аборигенной микрофлоры способна деградировать нефть и нефтепродукты в почве и грунте. Причем при обработке почвы смесью биодобавок биотрина и барды, взятых в соотношении 1:1, степень биодеградации заметно возрастает. Так для образцов почвы № 1, 2 и 3 она составила 80, 75 и 64% соответственно. Без обработки биодобавками - 60, 57 и 42%.

Таблица 1Результаты измерения рН в опытных и контрольных колбах
Название опытаНачальное Через 3 суток
Образец № 1 с биотрином 6,27,2
Образец № 1 с бардой 6,27,2
Образец № 1 без биодобавок 6,26,8
Образец № 2 с биотрином 6,27,1
Образец № 2 с бардой 6,27,0
Образец № 2 без биодобавок 6,26,9
Образец № 3 с биотрином 6,27,1
Образец № 3 с бардой 6,27,1
Образец № 3 без биодобавок 6,26,9
Контроль 6,26,2
Таблица 2Влияние количества смеси биодобавок на степень биодеградании нефти
Концентрация биодобавок, % 00,01 0,030,05 0,080,10
Степень биодеградации нефти, %68 78 8491 9191
Таблица 3
Название опытаНачальное Через 3 суток
Образец № 1 с биодобавками 6,27,0
Образец № 1 без биодобавок 6,26,8
Образец № 2 с биодобавками 6,27,1
Образец № 2 без биодобавок 6,26,7
Образец № 3 с биодобавками 6,27,1
Образец № 3 без биодобавок 6,26,8
Контроль с биодобавками 6,2 6,2
Контроль без биодобавок6,2 6,2
Таблица 4Динамика роста микроорганизмов в среде с углеводородами с добавлением смеси биодобавок
Вариант Количество микроорганизмов, растущих на МПА, кл/мл, час
0 2436 48
1. Гексадекан 1·1058·1075·1081·109
2. Диз. топливо1·10 59·10 77·10 89·10 8
3. Нефть1·10 58·10 73·10 85·10 8
4. Мазут1·10 59·10 62·10 74·10 7

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ выделения и активации консорциума аборигенных нефтеокисляющих микроорганизмов, включающий отбор проб с нефтезагрязненных почв и грунтов, выделение консорциума аборигенных нефтеокисляющих микроорганизмов, отличающийся тем, что после выделения проводят активацию консорциума аборигенных нефтеокисляющих микроорганизмов с использованием смеси биотрина с отходом спиртового производства - барды при соотношении компонентов 1:1 в количестве не менее 0,01 мас.%.

www.freepatent.ru

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АБОРИГЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ ДЛЯ БОРЬБЫ С НЕФТЯНЫМ ЗАГРЯЗНЕНИЕМ ПОДЗЕМНЫХ ВОД

  • Home
  • Documents
  • ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АБОРИГЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ ДЛЯ БОРЬБЫ С НЕФТЯНЫМ ЗАГРЯЗНЕНИЕМ ПОДЗЕМНЫХ ВОД
  • Published on04-Apr-2017

  • View214

  • Download1

Transcript

  • © В. Т. Хмурчик, Н. Г. Максимович, 2007 123 ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 2007 Биология Вып. 5 (10) УДК 556.315:556.388:556.46 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АБОРИГЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ ДЛЯ БОРЬБЫ С НЕФТЯНЫМ ЗАГРЯЗНЕНИЕМ ПОДЗЕМНЫХ ВОД В. Т. Хмурчикa, Н. Г. Максимовичb a Институт экологии и генетики микроорганизмов РАН, Пермь, 614081,ул. Голева, 13 b Естественнонаучный институт, Пермь, 614990, ул. Генкеля, 4 Рассматриваются методы биологической очистки природных сред от загрязнения нефтью и нефтепродуктами. Опробован способ борьбы с нефтяным загрязнением вод на территории Полазненского нефтяного месторождения Пермского края с помощью бактериального пре- парата, созданного на основе аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры. Предприятия нефтедобывающего и перерабаты- вающего комплекса оказывают существенное воз- действие на окружающую среду. В районах их рас- положения происходит изменение химического и микробиологического состава подземных и поверх- ностных вод и грунтов в результате их загрязнения нефтепродуктами, поверхностно-активными веще- ствами, различными химическими реагентами. На- пример, на Полазненском месторождении нефти в течение 50-летнего периода эксплуатации на по- верхности грунтовых вод сформировались линзы нефти. Данный участок имеет ряд особенностей, обусловленных развитием карста, которые способ- ствуют загрязнению первого от поверхности водо- носного горизонта нефтепродуктами. Здесь все ат- мосферные осадки, а также проливы, разливы (в том числе нефти) практически беспрепятственно поглощаются трещиноватыми породами, воронка- ми, котловинами и другими карстовыми формами (Горбунова, Максимович, 1991; Бузмаков, Коста- рев, 2003; Максимович, Казакевич, 2004). Подземные воды являются благоприятной сре- дой для существования микроорганизмов, которые способны трансформировать не только природные органические компоненты, но и большое количе- ство ксенобиотиков (Ghiorse, Wilson, 1988; Kolbel- Boelke, Anders, Nehrkorn, 1988; Kaiser, Bollag, 1990). Считается, что загрязненные подземные во- ды содержат адаптировавшиеся микробные попу- ляции, способные к трансформации загрязняющих веществ в окислительно-восстановительных усло- виях. Существенным фактором является наличие акцепторов электронов (агентов окисления) в дос- таточном количестве (Criddle, McCarty, Elliott et al., 1986; Edwards, Grbic-Galic, 1992; Elmen, Pan, Leung et al., 1997; Lovley, 1997; Caldwell, Tanner, Suflita, 1999; Robertson, Bowman, Franzmann et al., 2001; Kleikemper, Schroth, Sigler et al., 2002). Та- ким образом, наличие активной микрофлоры в по- земных водах обеспечивает процессы их само- очищения. Однако естественное самоочищение природных объектов, например от нефтяного за- грязнения, является длительным процессом, про- должающимся от одного до нескольких десятиле- тий. Начиная с 70-х гг. ХХ в. ведется активный по- иск способов интенсификации биологической де- градации углеводородов в природной среде. Име- ются два принципиальных подхода к решению этой проблемы: стимуляция естественной нефтео- кисляющей микрофлоры путем создания опти- мальных условий для ее развития и введение в за- грязненную экосистему активных углеводородо- кисляющих микроорганизмов наряду с добавками солей азота и фосфора. В некоторых ситуациях введение бактериальных нефтеокисляющих пре- паратов не только оправданно, но и совершенно необходимо. Например, в северных районах, где теплый период года непродолжителен, процессы биодеградации не успевают развернуться в полной мере. В таком случае повышение численности уг- леводородокисляющих микроорганизмов путем интродукции активных форм, безусловно, является полезным (Коронелли, 1996). Особенно актуально это для нашей страны, расположенной в основном в зоне холодного и умеренного климата. Следует отметить, что интродукция в нефтезагрязненную природную среду автохтонных (т. е. выделенных из этой среды) нефтеокисляющих микроорганиз- мов не оказывает негативного влияния на естест- венную экологическую обстановку (Морозов, Ни- колаев, 1978; Квасников, Клюшникова, 1981; Ко- ронелли, 1996). Биохимическая деструкция нефтепродуктов применяется главным образом для ликвидации по- верхностных разливов нефти. Отечественные и за-
  • 124 В. Т. Хмурчик, Н. Г. Максимович рубежные технологии борьбы с нефтяными за- грязнениями подземных вод основаны, как прави- ло, на использовании технических средств (сбор, откачка нефти и т.д.) или различных препаратов, в том числе и микробиологических («Путидойл», «Олеоворин», «Нафтокс», «Uni-rem», «Родер», «Центрин», «Псевдомин», «Дестройл», «Микро- мицет», «Лидер», «Деворойл» и др.). Борьба с нефтяным загрязнением подземных вод требует особых приемов и технологий, учитывающих осо- бенности гидродинамического режима подземных вод, литологический состав вмещающих пород и характер перераспределения нефти в системе «во- да – порода». Для борьбы с загрязнением подземных вод в районе Полазны из почв и подземных вод нефтя- ного месторождения выделено активное нефтео- кисляющее сообщество микроорганизмов, со- стоящее из двух штаммов бактерий, которые по культурально-морфологическим и физиолого- биохимическим свойствам были отнесены к Pseu- domonas aeruginosa и Pseudomonas fluorescens. Оба штамма бактерий – мезофиллы с границами хоро- шего роста и высокой активностью при темпера- туре 15–35˚С (оптимум 26+2˚С), обладают способ- ностью к денитрификации нитрата. Нефтедеструк- тирующую активность консорциума микроорга- низмов определяли по убыли индивидуальных компонентов нефти, регистрируемой общеприня- тыми методами газожидкостной хроматографии и ИК-спектрометрии в хлороформенных экстрактах из опытных образцов грунтовых вод Полазнинско- го нефтяного месторождения, искусственно за- грязненных 10 мас.% нефти и подвергнутой бакте- риальной обработке (2 об.% трехсуточной культу- ры консорциума с содержанием клеток 1.0.108 КОЕ/мл), и сравнивали с контрольными образца- ми, не подвергнутыми бактериальной обработке. Натурные испытания проводили на наблюдатель- ных скважинах Полазнинского карстового района, где над грунтовыми водами сформировалась неф- тяная линза (рисунок). Анализ ИК-спектров показал снижение интен- сивности пиков ароматических колец (1600 и 875- 750 см-1), Ch3- и Ch4-групп (2900, 2800, 1470, 1380, 720 см-1) и различных C-O связей (1740-1700, 1260, 1090 см-1) в контрольных и опытных образ- цах, которое было отчетливым в опытных образ- цах и слабым – в контрольных. В опытных образ- цах отмечено уменьшение значений спектральных коэффициентов K(I720/I1470) и C3(D720/D1380) и уве- личение значений спектральных коэффициентов C1(D1610/D720), C2(D750/D720) и K1(I750/I720), свиде- тельствующие о снижении доли н-парафиновых компонентов. После воздействия бактериального сообщества содержание н-алканов (Σn-C12-34) в нефти снизилось в 4.2 раза по сравнению с кон- тролем за счет деструкции, главным образом, низ- ко- и среднемолекулярных углеводородов, что не зависело от того, имели углеводороды четное или нечетное число атомов углерода. При этом наблю- далось значительное изменение в соотношении между н-алканами и нафтеновыми углеводорода- ми, а также н-алканами и изопреновыми углеводо- родами. По данным ИКС и ГЖХ, содержание н- алкильных структур под действием микроорга- низмов снизилось примерно в 4 раза. В то же вре- мя в контрольных образцах снижение содержания Схема биохимической очистки подземных вод
  • Использование аборигенной микрофлоры для борьбы с нефтяным загрязнением… 125 данных компонентов за счет действия физико- химических факторов не превышало 20%. В ре- зультате деятельности микроорганизмов в составе отдельных классов углеводородов нефти также произошли значительные изменения. Таким образом, исследования показали, что вы- деленное микробное сообщество способно исполь- зовать углеводороды нефти для поддержания своей жизнедеятельности и, следовательно, может быть использовано для интродукции в нефтезагрязнен- ные подземные воды Полазнинского нефтяного ме- сторождения с целью их биологической очистки. Данный консорциум может быть применен для очистки не только подземных, но и поверхностных и сточных вод. Его эффективность будет зависеть от конкретных (геохимических, литологических, гидродинамических) природных условий. Метод может быть использован как самостоятельный, так и как дополнительный к традиционным и повышать при этом эффективность очистки. Особый эффект данной технологии можно ожидать при очистке по- род от сорбированных нефтепродуктов в зоне се- зонного колебания уровня подземных вод. Следует отметить, что в подземных водах, за- грязненных большими дозами органических ве- ществ, создается восстановительная обстановка, вследствие чего деятельность аэробных окисляю- щих микроорганизмов становится невозможной. В таких случаях процессы естественного самоочи- щения идут за счет деятельности факультативно анаэробных и анаэробных микроорганизмов (Criddle, McCarty, Elliott et al., 1986, Lovley, 1997; Robertson, Bowman, Franzmann et al., 2001). Так, в подземных водах, загрязненных нефтью и нефте- продуктами, часто обнаруживают способные к их анаэробному окислению сульфатвосстанавливаю- щие бактерии (Coates, Woodward, Allen et al., 1997; Kropp, Davidova, Suflita, 2000; Robertson, Bowman, Franzmann et al., 2001; Townsend, Prince, Suflita, 2004). Поэтому ускорение естественного само- очищения таких подземных вод может быть дос- тигнуто активизацией деятельности анаэробного сульфатвосстанавливающего сообщества путем добавления дополнительных легкометаболизируе- мых микроорганизмами субстратов (например ор- ганических кислот или углеводов) (Kaiser, Bollag, 1990). Образующийся в процессе сульфатредукции сероводород будет мигрировать с током подзем- ных вод, окисляться до элементарной серы на окислительном геохимическом барьере и выпадать в осадок. В настоящее время на Полазнинском ме- сторождении авторами ведется разработка методов очистки нефтезагрязненных подземных вод за счет интенсификации деятельности анаэробных микро- организмов. Исследования выполнены при поддержке гран- та РФФИ №04-05-96039-р2004урал_а Список литературы Бузмаков С.А., Костарев С.М. Техногенные изме- нения компонентов природной среды в нефте- добывающих районах Пермской области. Пермь, 2003. 171 с. Горбунова К.А., Максимович Н.Г. Техногенное воздействие на закарстованные территории Пермской области. // География и природные ресурсы. 1991. № 3. С. 42–46. Квасников Е.И., Клюшникова Т.М. Микроорганиз- мы – деструкторы нефти в водных бассейнах. Киев: Наукова думка, 1981. 132 с. Коронелли Т.В. Принципы и методы интенсифи- кации биологического разрушения углеводоро- дов в окружающей среде // Прикл. биохим. и микробиол. 1996. Т. 32, № 6. С. 579–585. Максимович Н.Г., Казакевич С.В. Геоэкологические особенности Полазнинского месторождения нефти // Геология и полезные ископаемые За- падного Урала: Материалы регион. науч.-практ. конф. Пермь, 2004. С. 277–280. Морозов Н.В., Николаев В.Н. Влияние условий сре- ды на развитие нефтеразлагающих микроорга- низмов // Гидробиол. журн. 1978. Т. 14, № 4. С. 55–59. Caldwell M.E., Tanner R.S., Suflita J.M. Microbial me- tabolism of benzene and the oxidation of ferrous iron under anaerobic conditions: Implication for bioremediation // Anaerobe. 1999. Vol. 5. Р. 595– 603. Coates J.D., Woodward J., Allen J. et al. Anaerobic degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons and alkanes in petroleum-contaminated marine harbor sediments // Appl. Environ. Microbiol. 1997. Vol 63, iss 9. P. 3589–3593. Criddle C.S., McCarty P.L., Elliott M.C. et al. Reduc- tion of hexachloroethane to tetrachloroethylene in groundwater // J. Contaminant Hydrol. 1986. Vol. 1. Р. 133–142. Edwards E.A., Grbic-Galic D. Complete mineraliza- tion of benzene by aquifer microorganisms under strictly anaerobic conditions // Appl. Environ. Microbiol. 1992. Vol. 58. Р. 2663–2666. Elmen J., Pan W., Leung S.Y. et al. Kinetics of toluene degradation by a nitrate-reducing bacterium iso- lated from a groundwater aquifer // Biotech. Bio- eng. 1997. Vol. 55. Р. 82–90. Ghiorse W.C., Wilson J.T. Microbial ecology of the terrestrial subsurface // Adv. Appl. Microbiol. 1988. Vol. 33. Р. 107–172. Kaiser J.-P., Bollag J.-M. Microbial activity in the ter- restrial subsurface // Experientia. 1990. Vol. 46. Р. 797–806. Kleikemper J., Schroth M.H., Sigler W.V. et al. Activi- ty and diversity of sulfate-reducing bacteria in a petroleum hydrocarbon-contaminated aquifer // Appl. Environ. Microbiol. 2002. Vol. 68. Р. 1516– 1523. Kolbel-Boelke J., Anders E.-M., Nehrkorn A. Microbi-
  • 126 В. Т. Хмурчик, Н. Г. Максимович al communities in the saturated groundwater envi- ronment. II: Diversity of bacterial communities in a pleistocene sand aquifer and their in vitro activi- ties // Microb. Ecol. 1988. Vol. 16. Р. 31–48. Kropp K.G., Davidova I.A., Suflita J.M. Anaerobic oxidation of n-dodecane by an addition reaction in a sulfate-reducing bacterial enrichment culture // Appl. Environ. Microbiol. 2000. Vol 66, iss 12. P. 5393–5398. Lovley D.R. Microbial Fe(III) reduction in subsurface environments // FEMS Microbiol. Rev. 1997. Vol. 20. Р. 305–313. Robertson W.J., Bowman J.P., Franzmann P.D. et al. Desulfosporosinus meridiei sp nov., a spore- forming sulfate-reducing bacterium isolated from gasoline-contaminated groundwater // Int. J. Syst. Evolut. Microbiol. 2001. Vol. 51. Р. 133–140. Townsend T.G., Prince R.C., Suflita J.M. Anaerobic biodegradation of alicyclic constituents of gasoline and natural gas condensate by bacteria from an anoxic aquifer // FEMS Microbiol. Ecol. 2004. Vol. 49. P. 129–135. Поступила в редакцию 20.05.2006 Use of autochtonous microflora for purification of oil polluted ground water G.N. Maximovich, V.T. Khmurchik The remediation techniques of oil-polluted environments are observed. Authors tested the biotechnological method based on the usage of autochtonous microflora biopreparation to remediate ground water. The results of the test are discussed.

documents.tips

ВЛИЯНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ПОЧВ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ НЕФТЕПРОДУКТАМИ, НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИХ ДЕГРАДАЦИИ ПУТЕМ ПРИМЕНЕНИЯ ЭКОБИОПРЕПАРАТА «ЦЕНТРИН» И БИОСТИМУЛЯЦИИ АБОРИГЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ

 ВЛИЯНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ПОЧВ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ НЕФТЕПРОДУКТАМИ, НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИХ ДЕГРАДАЦИИ ПУТЕМ ПРИМЕНЕНИЯ ЭКОБИОПРЕПАРАТА «ЦЕНТРИН» И БИОСТИМУЛЯЦИИ АБОРИГЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ

М. Г. Щербаков, Ю. Е. Петраков, Я. В. Войнов, П. Г. Васильев, М. С. Петряков

(Научно-исследовательский центр ФГКУ «33 Центральный научно-исследовательский испытательный институт» Министерства обороны Российской Федерации)

Вследствие широкого массового применения нефть и продукты ее переработки включены в пятерку наиболее опасных загрязнителей окружающей природной среды [8, 11]. В результате бурного развития промышленности масштабы загрязнения выросли настолько, что природные экосистемы уже не в состоянии справиться с ним самостоятельно. Так, например, ежегодно из добываемых в Российской Федерации 300 млн т нефти от 4,5 до 30 млн т теряется в результате проливов и утечек. Это, помимо прямых убытков, наносит серьезный экологический ущерб [2, 10].

Для ликвидации последствий загрязнения территорий и водоемов нефтью или продуктами ее переработки (углеводородами) применяют следующие методы очистки: механическое удаление, сорбцию, экстракцию, термическое разрушение, микробиологическую деградацию [12, 15]. Способ микробиологической деградации признается многими учеными наиболее перспективным ввиду своей экологичности и относительно низкой стоимости [1, 4, 8, 12].

Анализ данных литературы позволяет сделать вывод, что эффективность микробиологической деградации (биодеградации) углеводородов в почве зависит от следующих физико-химических параметров загрязненного объекта [5, 14]:

- вид нефтепродукта;

- степень загрязнения;

- влажность;

- температура окружающей среды;

- доступность кислорода;

- наличие источников биогенных элементов;

- концентрация ионов водорода;

- физиологические особенности микроорганизмов, проявляющиеся при окислении индивидуальных углеводородов и их смесей.

В связи с этим определение целесообразности применения для очистки загрязненных почв микробиологических методов и выбор оптимального метода очистки будут зависеть от значений этих параметров.

Целью данной работы являлось экспериментальное определение эффективности применения микробиологических методов очистки почв, загрязненных нефтепродуктами, в зависимости от значений физико-химических параметров загрязненного объекта.

На первом этапе исследований оценивалось влияние концентрации дизельного топлива (ДТ) в почве на эффективность ее очистки способами биостимуляции аборигенной микрофлоры или внесения в загрязненную почву экобиопрепарата (ЭБП) «Центрин». Образцы загрязненных почв готовили следующим образом. Почву, отобранную в лесной зоне, высушивали до воздушно-сухого состояния, удаляли из нее крупные включения и просеивали через сито с размером отверстий 0,6 мм. Подготовленную таким образом почву вносили в чашки Петри по 10,0 ± 0,1 г. Затем в чашки с почвой вносили ДТ. Исходная концентрация ДТ в почве составляла 10, 30, 50, 100, 150, 200 мг х г-1. В опытные образцы вносили микробную суспензию, полученную путем разведения ЭБП «Центрин» в среде Раймонда до заданной концентрации клеток Pseudomonas fluorescens (1 х 107 кл х г-1). Параллельно готовили пробы, в которых почва, загрязненная ДТ, орошалась средой Раймонда. Еженедельно проводились орошение всех почвенных образцов дистиллированной водой для поддержания влажности почвы на уровне 30-40 % и перемешивание почвы для улучшения ее аэрируемости. Также готовили контрольные пробы, в которых почва орошалась дистиллированной водой без перемешивания. Пробы инкубировали при комнатной температуре (20 ± 2 °С) в течение 42 суток. Содержание ДТ в пробах на различных сроках наблюдения определяли методом ИК-спектрометрии [6]. Результаты исследований представлены в табл. 1.

Полученные результаты (табл. 1) исследований свидетельствуют, что при низких концентрациях ДТ в почве (10 мг х г-1) ее обработка методом биостимуляции аборигенной микрофлоры, так же как и внесение ЭБП, позволяет добиться высокой степени деградации ДТ, которая через 42 суток после обработки составила 75 и 78 % соответственно. Следовательно, при использованной исходной концентрации ДТ в почве внесение «Центрина» в реакционную систему не привело к существенному усилению разложения ДТ по сравнению с биостимуляцией аборигенной микрофлоры. Способность природной микрофлоры утилизировать ДТ при концентрации 10 мг х г-1 после ее стимуляции (внесения минеральных удобрений, орошения, рыхления) обеспечивает самоочищение почвы.

При повышении исходного содержания ДТ в почве до 30 и 50 мг х г-1 ее обработка путем внесения ЭБП позволяет получить высокую степень деградации - 78,3 % и 69,8 % соответственно, а при дальнейшем увеличении исходного содержания ДТ эффективность деградации при использовании данного метода снижается (см. табл. 1). Использование метода биостимуляции аборигенной микрофлоры в данных условиях менее эффективно. Степень деградации при содержании ДТ 30, 50 и 100 мг х г-1 составила 48,7, 27,4 и 13,8 % соответственно, а при дальнейшем увеличении находилась на уровне контроля.

Таблица 1

Эффективность биодеградации дизельного топлива

На следующем этапе исследований проводили сравнение эффективности очистки почвы, загрязненной мазутом, различными способами микробиологической очистки в зависимости от исходной концентрации мазута. Для этого в чашки Петри вносили по 10,0 ± 0,1 г подготовленной почвы и мазут в количестве, обеспечивающем его исходную концентрацию 10, 30, 50, 100, 150 и 200 мг х г-1. В опытные образцы вносили микробную суспензию, полученную путем разведения ЭБП «Центрин» в среде Раймонда. Параллельно готовили пробы, в которых почва, загрязненная мазутом, орошалась средой Раймонда. Еженедельно для поддержания влажности почвы на уровне 30-40 % проводилось орошение всех испытуемых образцов дистиллированной водой и перемешивание почвы для улучшения ее аэри-руемости. Также готовили контрольные пробы, в которых почва орошалась дистиллированной водой без перемешивания. Пробы инкубировали при комнатной температуре - 20 ± 2 °С. На различных сроках наблюдения определяли остаточное содержание мазута в пробах.

Представленные в табл. 2 результаты исследований свидетельствуют, что применение для очистки загрязненной мазутом почвы ЭБП «Центрин» позволяет эффективно утилизировать мазут при исходной его концентрации от 10 до 100 мг х г-1 (степень деградации через 42 суток после обработки соста-вила 43,8-71,3 %), при больших концентрациях мазута его деградация незначительна. Очистка почвы методом биостимуляции аборигенной микрофлоры позволила получить высокую степень деградации мазута при его исходной концентрации 10 и 30 мг х г-1 (степень деградации через 42 суток составила 59 и 43 % соответственно). При этом при исходном содержании мазута 10 мг х г-1 эффективность очистки была сравнима с эффективностью очистки путем внесения ЭБП. При больших концентрациях мазута в почве очистка методом биостимуляции не дала значительного эффекта.

Таблица 2

Эффективность биодеградации мазута в почве

Таким образом, проведенные исследования установили, что при содержании в почве нефтепродуктов в концентрации до 10 мг х г-1 очистку целесообразно проводить методом биостимуляции аборигенной микрофлоры, так как внесение ЭБП при этом не дает заметного повышения степени деградации не-фтепродуктов. При больших концентрациях нефтепродуктов (до 150 мг х г-1) более эффективна очистка методом внесения ЭБП «Центрин». При концентрациях более 150 мг х г-1 проведение очистки методами локальной обработки неэффективно и, вероятно, целесообразно использование альтернативных методов (жидкофазной или твердофазной обработки с выемкой загрязненного грунта).

Для проверки последнего предположения проводилась оценка эффективности биодеградации нефтепродуктов при снижении их исходного содержания в почве путем внесения чистой почвы и струк-тураторов (моделирование процесса микробиологической очистки методом твердофазной обработки с выемкой грунта).

Сравнительную оценку эффективности очистки почв методами биостимуляции и биоаугментации проводили на образцах грунтов, отобранных в местах размещения войсковых хранилищ ГСМ (в. ч. № 55471 - г. Наро-Фоминск и в. ч. № 67753 - п. Алабино). Информация о пробах грунтов, загрязненных нефтепродуктами, представлена в табл. 3.

Из представленных в табл. 3 данных видно, что исходная концентрация нефтепродуктов в образцах находится на уровне 87,6-214,7 г х кг-1.

Таблица 3

Характеристика проб грунта, отобранных на территориях в. ч. № 55471 и 67753

Опытные образцы загрязненных грунтов обрабатывали суспензией ЭБП, приготовленной путем разведения готовой формы препарата «Центрин». Пробы инкубировали при температуре 20 ± 2 °С в течение 28 суток. Биологическую концентрацию клеток микроорганизмов определяли методом десятикратных разведений с последующим высевом на мясо-пептонный агар. В контрольные образцы загрязненных грунтов вносили среду Раймонда, пробы тщательно перемешивали. В процессе инкубирования поддерживали абсолютную влажность почвы на уровне 25-35 %. Содержание нефтепродуктов в пробах на различных сроках наблюдения определяли методом ИК-спектрометрии [15]. Результаты исследований представлены в табл. 4.

Таблица 4

Эффективность очистки нефтезагрязненных грунтов

Полученные данные свидетельствуют, что внесение в загрязненные образцы почвы ЭБП «Центрин» позволило добиться более высокой степени деградации нефтепродуктов по сравнению со способом биостимуляции аборигенной микрофлоры во всех вариантах. Степень деградации нефтепродуктов через 28 суток после обработки образцов составила 5,3-14,3 % при очистке методом биостимуляции аборигенной микрофлоры, 18,6-46,6 % - при использовании ЭБП «Центрин», то есть была в 3-4,5 раза выше. В то же время по результатам исследований можно сделать вывод, что увеличение исходной концентрации нефтепродуктов в образцах почвы приводит к снижению эффективности очистки как методом биостимуляции, так и при использовании ЭБП. Так, например, в образце 1, где исходная концентрация нефтепродуктов составляла 87,6 ± 4,2 г х кг-1, степень их деградации через 28 суток после обработки была равна 46,6 ± 4,8 %, в образце 2 (исходная концентрация нефтепродуктов - 140,1 ± 4,9 г х кг-1) - 27,1 ± 3,2 %, а в образце 3 (исходная концентрация нефтепродуктов -214,7 ± 6,9 г х кг-1) - 18,6 ± 4,8 %.

Далее оценивали влияние на эффективность очистки мероприятий, направленных на снижение исходной концентрации нефтепродуктов и структурирование загрязненных грунтов. В загрязненные грунты (табл. 3) вносили песок и чистую почву с целью снижения токсичности нефтепродуктов и улучшения условий аэрирования грунтов. Соотношение частей песка, чистой и загрязненной почвы подбирали таким образом, чтобы концентрация нефтепродуктов после смешения была на уровне 3 % от массы образцов, а доля песка была примерно равной 1/3 массы почвы после смешения. Информация о пропорциях смешения загрязненных грунтов с песком и чистой почвой представлена в табл. 5.

Таблица 5

Соотношение частей при смешении загрязненных грунтов с песком и чистой почвой. Содержание нефтепродуктов в исходных грунтах и после смешения

Опытные образцы загрязненных грунтов, смешанных с песком и чистой почвой, обрабатывали суспензией, приготовленной из жидкой готовой формы путем ее разведения средой Раймонда. Пробы инкубировали при температуре 20 ± 1 °С. Биологическую концентрацию клеток микроорганизмов определяли методом десятикратных разведений с последующим высевом на мясо-пептонный агар. Контрольные образцы грунтов обрабатывали средой Раймонда и тщательно перемешивали. Содержание нефтепродуктов в пробах на различных сроках наблюдения определяли методом ИК-спектрометрии. Результаты исследований представлены в табл. 6.

Таблица 6

Количество нефтепродуктов в пробах на различных сроках наблюдения

Результаты исследований показали, что разбавление загрязненных грунтов песком и чистой почвой позволяет повысить степень деградации нефтепродуктов как при внесении ЭБП, так и при использовании способа биостимуляции аборигенной микрофлоры. Степень деградации нефтепродуктов через 28 суток после обработки грунтов способом биостимуляции составила для различных образцов 26,454 %, а после обработки грунтов ЭБП «Центрин» - 68-83,1 %.

Таким образом, предварительная обработка загрязненных грунтов путем их смешения с песком и чистой почвой позволила повысить эффективность очистки в случае биостимуляции аборигенной микрофлоры более чем в 3 раза, а в случае применения биопрепарата - в 2-2,5 раза. С другой стороны, результаты исследований показали, что снижение исходной концентрации нефтепродуктов приводит к усилению активности аборигенной микрофлоры и снижению вклада в биодеградацию ЭБП. Так, в случае обработки неразбавленных грунтов степень деградации нефтепродуктов препаратом была выше в 3-4,5 раза по сравнению с биостимуляцией, а в случае обработки разбавленных грунтов - в 1,5-3 раза.

Одним из существенных факторов, влияющих на эффективность процесса биодеградации нефтепродуктов, является температура окружающей среды. Температура окружающей среды - фактор, который нельзя скорректировать, поэтому от ее значения существенным образом будет зависеть выбор метода микробиологической очистки.

В литературе встречаются противоречивые данные о зависимости биодеградационной активности углеводородокисляющей микрофлоры от температуры. С одной стороны, имеются сведения о том, что оптимальной для биодеградации нефтепродуктов является температура около 20 °С. В то же время встречаются публикации, указывающие, что с увеличением температуры до 30-40 °С биодеградационная активность микроорганизмов возрастает. В литературе приводятся сведения о том, что биостимуляция аборигенной микрофлоры неэффективна при низких температурах, при этом рекомендовано применение ЭБП.

Нами проведены исследования, целью которых было сравнение эффективности очистки почв, загрязненных нефтепродуктами, способом биостимуляции аборигенной микрофлоры и путем внесения в загрязненную почву ЭБП (на примере «Центрина») в зависимости от температуры окружаю-щей среды. Кроме того, определялся диапазон температур, при которых целесообразно применять тот или иной способ микробиологической очистки.

Оценивалось влияние температуры на эффективность биодеградации ДТ. В чашки Петри вносили по 10,0 ± 0,1 г предварительно подготовленной почвы. Затем в чашки с почвой вносили по 0,50 ± 0,01 г ДТ и тщательно перемешивали. Опытные образцы обрабатывали суспензией биопрепарата «Центрин», полученной путем разведения готовой формы препарата средой Раймонда. Контрольные образцы обрабатывали средой Раймонда и тщательно перемешивали. Пробы инкубировали при температурах 5, 10, 15, 20, 25, 30 и 35 °С в течение 42 суток.

На различных сроках наблюдения методом ИК-спектрометрии определяли остаточное содержание ДТ в пробах. Зависимость количества утилизированного ДТ (степень деградации) от температуры инкубирования проб показана на рис. 1.

Из анализа данных, представленных на рис. 1, следует, что температурный оптимум для биодеградации ДТ в данных условиях наблюдался в диапазоне 15-25 °C. Степень деградации ДТ через 42 суток после обработки проб ЭБП в этом диапазоне составляла не менее 68,5 %, тогда как при температурах 10 и 30 °C - 42,7 и 47,8 % соответственно. Степень деградации ДТ при биостимуляции аборигенной микрофлоры при температурах 10 и 30 °C составила соответственно 13,9 и 18,6 %, а в диапазоне 15-25 °C - 23,5-27,4 %. Следовательно, температурный диапазон 15-25 °C является оптимальным и для проведения биостимуляции. При этом применение ЭБП «Центрин» при всех значениях температур позволило повысить степень деградации ДТ по сравнению со способом биостимуляции более чем в 1,8-3 раза. При температуре ниже 10 °С и выше 30 °C биодеградация ДТ незначительна.

Рис. 1. Влияние температуры на эффективность биодеградации дизельного топлива

Далее оценивалось влияние температуры на эффективность биодеградации в почве мазута при использовании различных способов микробиологической очистки.

В чашки Петри вносили по 10,0 ± 0,1 г предварительно подготовленной почвы. Затем в чашки с почвой вносили по 0,50 ± 0,01 г мазута и тщательно перемешивали. Опытные образцы обрабатывали суспензией ЭБП «Центрин», полученной путем разведения готовой формы препарата средой Раймонда. Исходная концентрация жизнеспособных клеток микроорганизмов в почве после обработки составляла 5 х 107 кл х г-1. Контрольные образцы обрабатывали средой Раймонда и тщательно перемешивали. Пробы инкубировали при температурах 5, 10, 15, 20, 25, 30 и 35 °С.

На различных сроках наблюдения методом ИК-спектрометрии определяли остаточное содержание мазута в пробах.

Анализ представленных на рис. 2 результатов исследований свидетельствует, что внесение в загрязненную мазутом почву ЭБП «Центрин» позволяет добиться более высокой степени деградации мазута по сравнению с методом биостимуляции аборигенной микрофлоры при любой температуре окружающей среды.

Рис. 2. Влияние температуры на эффективность деградации мазута

Результаты данных исследований подтверждают результаты оценки влияния температуры на эффективность деградации ДТ (оптимальный температурный диапазон - 15-25 °C). В целом полученные данные аналогичны результатам наших исследований по изучению влияния эффективности биодеградации ДТ в водных системах, где оптимальный температурный диапазон для применения микробиологических способов очистки был установлен в пределах 16-23 °C.

Далее проводили сравнение эффективности деградации ДТ в почве способами биостимуляции аборигенной микрофлоры и внесения биопрепарата «Центрин» при различных значениях влажности почвы.

В чашки Петри вносили подготовленную почву в количестве 10,0 ± 0,1 г. Затем в почву вносили ДТ в количестве 0,50 ± 0,01 г и тщательно перемешивали. Далее загрязненную ДТ почву увлажняли: опытные образцы - суспензией ЭБП «Центрин» в среде Раймонда; контрольные - средой Раймонда. В опытные и контрольные образцы вносили по 1 см  суспензии ЭБП или среды Раймонда соответственно. Затем для создания в образцах различной влажности почву в чашках дополнительно увлажняли водопроводной водой в количестве 0, 1, 2, 3, 5, 8 и 14 см , после чего пробы тщательно перемешивали. Подготовленные образцы закрывали крышками и устанавливали в эксикаторы для уменьшения испаряемости влаги. Образцы инкубировали при температуре 22-24 °C. На различных сроках наблюдения отбирали пробы для определения остаточного содержания ДТ в почве. Результаты исследований представлены в табл. 7.

Таблица 7

Влияние влажности почвы на эффективность деградации дизельного топлива

Таблица 8

Влияние влажности почвы на эффективность деградации мазута

Целью следующего этапа исследований было определение диапазона концентрации ионов водорода в почве, при которых эффективно применение ЭБП «Центрин», а также сравнение эффективности очистки загрязненных нефтепродуктами почв путем внесения «Центрина» или биостимуляции аборигенной микрофлоры загрязненной почвы в зависимости от концентрации ионов водорода.

Почву для исследований отбирали в лесной зоне. Из почвы удаляли крупные включения и просеивали ее через сито с размером ячеек 5 х 5 мм. После этого почву высушивали на воздухе до воздушно-сухого состояния. Затем в химические стаканы вместимостью 500 см3 вносили по 100,0 0,1 г подго-товленной почвы, увлажняли ее водопроводной водой в количестве 25 см3, тщательно перемешивали. Затем вносили ДТ в объеме 10 см3. После тщательного перемешивания стаканы с почвой, загрязненной ДТ, устанавливали в вытяжной шкаф для выветривания легколетучих компонентов ДТ. Один раз в неделю содержимое стаканов перемешивали. Через 14 суток выветривания отбирали пробы для определения концентрации ионов водорода (рН водных вытяжек) и ДТ. Содержание ДТ определяли методом ИК-спектрометрии.

В результате было определено, что концентрация ДТ во всех образцах составляет 49,6 ± 0,8 мг х г-1, а рН водных вытяжек - 7,0 ± 0,5. После определения исходных концентраций ионов водорода и ДТ в пробах почвы готовили ряд образцов с различными рН. Для этого в стаканы с почвой вносили растворы едкого натра или соляной кислоты. Почву тщательно перемешивали и через сутки выстаивания проводили определение рН водных вытяжек.

В табл. 9 представлены данные по приготовленным образцам почвы.

Таблица 9

Данные по приготовленным образцам почвы

После определения рН водных вытяжек проводили обработку опытных образцов ЭБП «Центрин» и средой Раймонда. Для этого готовили суспензию препарата путем его разведения в среде Раймонда. Приготовленную суспензию в объеме 50 см3 вносили в почву и тщательно перемешивали. Контрольные образцы увлажняли тем же количеством водопроводной воды. Далее образцы инкубировали при температуре 23 ± 1 °С в течение 42 суток. Абсолютная влажность почвы поддерживалась на уровне от 30 до 40 %. Еженедельно определяли остаточное содержание ДТ в образцах.

Результаты исследований, представленные в табл. 10, свидетельствуют, что биодеградационный процесс активно протекает при значениях рН водных вытяжек, близких к нейтральным, тогда как при закис-лении или защелачивании почвы происходит заметное снижение биодеградационной активности.

Так, обработка загрязненных ДТ почвенных образцов способом биостимуляции аборигенной микрофлоры имела заметный эффект лишь при рН водной вытяжки почвы, равной 7,0. Степень деградации ДТ в этом случае составила через 42 суток после обработки образцов 25,4 % от исходного содержания ДТ в почве. При повышении концентрации ионов водорода в почве (рН водной вытяжки 8,1) степень деградации ДТ снизилась до 7,1 %, а при других значениях рН не превышала 4 % и была обусловлена, скорее всего, физико-химическими процессами в почве.

Таблица 10

Влияние кислотности почв на эффективность деградации дизельного топлива

Внесение в загрязненную ДТ почву ЭБП «Центрин» позволило повысить степень очистки почвы по сравнению со способом биостимуляции аборигенной микрофлоры в 1,8-2,2 раза. Степень деградации ДТ при концентрации ионов водорода соответствующей рН водной вытяжки 7,0 составила через 42 суток после обработки образцов препаратом 69,9 % от исходного количества, что в 2 раза больше, чем при биостимуляции аборигенной микрофлоры. При рН водной вытяжки, равной 8,1, деградация ДТ составляла на этот срок наблюдения 16,9 %, что также было примерно в 2 раза больше, чем при методе биостимуляции. При других значениях рН почвенных образцов деградация ДТ была несущественной.

Таким образом, проведенные исследования позволили установить следующее.

При низких концентрациях нефтепродуктов в почве (до 10 мг х г-1) внесение ЭБП «Центрин» не приводит к существенному ускорению их биодеградации по сравнению с биостимуляцией аборигенной микрофлоры. С увеличением концентрации нефтепродуктов от 10 до 100 мг х г-1 эффект от обработки почвы «Центрином», по сравнению с биостимуляцией аборигенной микрофлоры, возрастет в 2-3 раза. Более высокое содержание нефтепродуктов в почве требует проведения мероприятий по его снижению: внесения чистой почвы и структураторов. При содержании нефтепродуктов более 200 мг х г-1 внесение чистой почвы и структураторов без выемки грунта нецелесообразно (их тре-буемая масса будет превосходить массу очищаемой почвы в несколько раз). Более предпочтительна выемка загрязненного грунта с последующим его смешением с чистой почвой и структураторами и размещением в буртах на биоремедиационной площадке.

В пределах значений температуры окружающей среды 10-30 °C, независимо от значения температуры в этом интервале, использование ЭБП более эффективно по сравнению с методом биостимуляции аборигенной микрофлоры. Применение ЭБП при температурах ниже 10 °C и выше 30 °C нецелесообразно по причине их недостаточной эффективности при указанных температурных режимах биореме-диации. В этом случае (при температуре от 0 до 10 °С и выше 30 °С) целесообразно проведение очистки с выемкой грунта, буртованием и размещением его на биремедиационной площадке, что позволит повысить температуру почвы в бурте на несколько градусов.

Использование микробиологических способов деградации нефтепродуктов эффективно в диапазоне рН водных вытяжек почв от 6,5 до 7,5 рН. В остальных случаях перед применением микробиологической очистки необходимо проведение хемомелиоративных мероприятий, направленных на изменение рН загрязненных почв.

Список литературы

1. Вельков В. В. Биоремедиация: принципы, проблемы, подходы // Биотехнология. 1995. № 3-4. С. 20-27.

2. Вишняков Я. Д., Новоселов А. Л., Авраменко А. А., Загвоздкин В. К., Заикин И. А. Экономический анализ методов ликвидации последствий аварийных разливов нефти // Экология и промышленность России. 2005. № 6 (спецвыпуск). С. 42-45.

3. Исмаилов Н. М., Ахмедов А. Г., Ахмедов В. А. Рекультивация нефтезагрязненных земель сухих субтропиков Азербайджана // Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем: сб. науч. тр. АН СССР. М.: Наука, 1988. С. 206-230.

4. Капотина Л. Н., Морщакова Г. Н. Биологическая деструкция нефти и нефтепродуктов, загрязняющих почву и воду // Биотехнология. 1998. № 1. С. 85-92.

5. Коронелли Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде // Прикладная биохимия и микробиология. 1996. Т. 32. № 6. С. 579-585.

6. Крашенинников П. В. Правовые аспекты экологической безопасности в России // Экология и промышленность России. 2005. № 6 (спецвыпуск). С. 4-7.

7. Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в воде. Екатеринбург, 1998. Арх. в. ч. № 47051.

8. Новожилова М. И. Разложение углеводородов микроорганизмами // Труды института микробиологии и вирусологии АН КазССР. 1979. Т. 26. № 1. С. 53-64.

9. Плитман С. И., Гуськов Г. В., Ласточкина К. О. [и др.]. Гигиенические аспекты применения биодеструкторов для водных объектов и территорий, загрязненных нефтью // Гигиена и санитария. 1998. № 2. С. 11-12.

10. Протасов В. Ф., Молчанов А. В. Экология, здоровье и природопользование в России. М.: Финансы и статистика, 1995.

11. Разработка методики применения препаратов биотехнологии для очистки территорий, загрязненных нефтепродуктами, в местах дислокации ВС РФ: отчет о НИР (итоговый) / Ассоциация по агрохимическим, почвенным, экологическим и аэрокосмическим исследованиям в сельском хозяйстве Всероссийского НИИ удобрений и агропочвоведения им. Д. Н. Прянишникова.

12. Руководитель Ю. М. Капцинель. Арх. в. ч. № 47051, регистр. № 982В. М., 1995.

13. СидельниковаЛ. И., ЦветковаМ. Р. Биологическое обезвреживание опасных промышленных отходов // Экология промышленного производства. 1993. № 4. С. 25-29.

14. Холоденко В. П., Чугунов В. А., Кобелев В. А. [и др.]. Использование препаратов «Экойл» для очистки почв и водоемов от нефтяных загрязнений // Интродукция микроорганизмов в окружающую среду: тез. докл. конф. М., 1994. С. 113.

15. Leahy J. G., Colwell R. R. Microbial degradation of hydrocarbons in the environment // Microbiology review. 1990. V. 54. № 3. P. 305-315.

16. Martni B., Fieland V. P., Walter M. [et al.]. Survival of bacteria during aerosolization // Applied and Environmental Microbiology. 1990. № 11. P. 3463-3467.

 

Подробности Раздел: АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ РАЗВИТИЯ БИОТЕХНОЛОГИЙ

zoovet.info

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АБОРИГЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ ДЛЯ БОРЬБЫ С НЕФТЯНЫМ ЗАГРЯЗНЕНИЕМ ПОДЗЕМНЫХ ВОД

  • Home
  • Documents
  • ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АБОРИГЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ ДЛЯ БОРЬБЫ С НЕФТЯНЫМ ЗАГРЯЗНЕНИЕМ ПОДЗЕМНЫХ ВОД
  • Published on04-Apr-2017

  • View214

  • Download1

Transcript

  • © В. Т. Хмурчик, Н. Г. Максимович, 2007 123 ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 2007 Биология Вып. 5 (10) УДК 556.315:556.388:556.46 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АБОРИГЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ ДЛЯ БОРЬБЫ С НЕФТЯНЫМ ЗАГРЯЗНЕНИЕМ ПОДЗЕМНЫХ ВОД В. Т. Хмурчикa, Н. Г. Максимовичb a Институт экологии и генетики микроорганизмов РАН, Пермь, 614081,ул. Голева, 13 b Естественнонаучный институт, Пермь, 614990, ул. Генкеля, 4 Рассматриваются методы биологической очистки природных сред от загрязнения нефтью и нефтепродуктами. Опробован способ борьбы с нефтяным загрязнением вод на территории Полазненского нефтяного месторождения Пермского края с помощью бактериального пре- парата, созданного на основе аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры. Предприятия нефтедобывающего и перерабаты- вающего комплекса оказывают существенное воз- действие на окружающую среду. В районах их рас- положения происходит изменение химического и микробиологического состава подземных и поверх- ностных вод и грунтов в результате их загрязнения нефтепродуктами, поверхностно-активными веще- ствами, различными химическими реагентами. На- пример, на Полазненском месторождении нефти в течение 50-летнего периода эксплуатации на по- верхности грунтовых вод сформировались линзы нефти. Данный участок имеет ряд особенностей, обусловленных развитием карста, которые способ- ствуют загрязнению первого от поверхности водо- носного горизонта нефтепродуктами. Здесь все ат- мосферные осадки, а также проливы, разливы (в том числе нефти) практически беспрепятственно поглощаются трещиноватыми породами, воронка- ми, котловинами и другими карстовыми формами (Горбунова, Максимович, 1991; Бузмаков, Коста- рев, 2003; Максимович, Казакевич, 2004). Подземные воды являются благоприятной сре- дой для существования микроорганизмов, которые способны трансформировать не только природные органические компоненты, но и большое количе- ство ксенобиотиков (Ghiorse, Wilson, 1988; Kolbel- Boelke, Anders, Nehrkorn, 1988; Kaiser, Bollag, 1990). Считается, что загрязненные подземные во- ды содержат адаптировавшиеся микробные попу- ляции, способные к трансформации загрязняющих веществ в окислительно-восстановительных усло- виях. Существенным фактором является наличие акцепторов электронов (агентов окисления) в дос- таточном количестве (Criddle, McCarty, Elliott et al., 1986; Edwards, Grbic-Galic, 1992; Elmen, Pan, Leung et al., 1997; Lovley, 1997; Caldwell, Tanner, Suflita, 1999; Robertson, Bowman, Franzmann et al., 2001; Kleikemper, Schroth, Sigler et al., 2002). Та- ким образом, наличие активной микрофлоры в по- земных водах обеспечивает процессы их само- очищения. Однако естественное самоочищение природных объектов, например от нефтяного за- грязнения, является длительным процессом, про- должающимся от одного до нескольких десятиле- тий. Начиная с 70-х гг. ХХ в. ведется активный по- иск способов интенсификации биологической де- градации углеводородов в природной среде. Име- ются два принципиальных подхода к решению этой проблемы: стимуляция естественной нефтео- кисляющей микрофлоры путем создания опти- мальных условий для ее развития и введение в за- грязненную экосистему активных углеводородо- кисляющих микроорганизмов наряду с добавками солей азота и фосфора. В некоторых ситуациях введение бактериальных нефтеокисляющих пре- паратов не только оправданно, но и совершенно необходимо. Например, в северных районах, где теплый период года непродолжителен, процессы биодеградации не успевают развернуться в полной мере. В таком случае повышение численности уг- леводородокисляющих микроорганизмов путем интродукции активных форм, безусловно, является полезным (Коронелли, 1996). Особенно актуально это для нашей страны, расположенной в основном в зоне холодного и умеренного климата. Следует отметить, что интродукция в нефтезагрязненную природную среду автохтонных (т. е. выделенных из этой среды) нефтеокисляющих микроорганиз- мов не оказывает негативного влияния на естест- венную экологическую обстановку (Морозов, Ни- колаев, 1978; Квасников, Клюшникова, 1981; Ко- ронелли, 1996). Биохимическая деструкция нефтепродуктов применяется главным образом для ликвидации по- верхностных разливов нефти. Отечественные и за-
  • 124 В. Т. Хмурчик, Н. Г. Максимович рубежные технологии борьбы с нефтяными за- грязнениями подземных вод основаны, как прави- ло, на использовании технических средств (сбор, откачка нефти и т.д.) или различных препаратов, в том числе и микробиологических («Путидойл», «Олеоворин», «Нафтокс», «Uni-rem», «Родер», «Центрин», «Псевдомин», «Дестройл», «Микро- мицет», «Лидер», «Деворойл» и др.). Борьба с нефтяным загрязнением подземных вод требует особых приемов и технологий, учитывающих осо- бенности гидродинамического режима подземных вод, литологический состав вмещающих пород и характер перераспределения нефти в системе «во- да – порода». Для борьбы с загрязнением подземных вод в районе Полазны из почв и подземных вод нефтя- ного месторождения выделено активное нефтео- кисляющее сообщество микроорганизмов, со- стоящее из двух штаммов бактерий, которые по культурально-морфологическим и физиолого- биохимическим свойствам были отнесены к Pseu- domonas aeruginosa и Pseudomonas fluorescens. Оба штамма бактерий – мезофиллы с границами хоро- шего роста и высокой активностью при темпера- туре 15–35˚С (оптимум 26+2˚С), обладают способ- ностью к денитрификации нитрата. Нефтедеструк- тирующую активность консорциума микроорга- низмов определяли по убыли индивидуальных компонентов нефти, регистрируемой общеприня- тыми методами газожидкостной хроматографии и ИК-спектрометрии в хлороформенных экстрактах из опытных образцов грунтовых вод Полазнинско- го нефтяного месторождения, искусственно за- грязненных 10 мас.% нефти и подвергнутой бакте- риальной обработке (2 об.% трехсуточной культу- ры консорциума с содержанием клеток 1.0.108 КОЕ/мл), и сравнивали с контрольными образца- ми, не подвергнутыми бактериальной обработке. Натурные испытания проводили на наблюдатель- ных скважинах Полазнинского карстового района, где над грунтовыми водами сформировалась неф- тяная линза (рисунок). Анализ ИК-спектров показал снижение интен- сивности пиков ароматических колец (1600 и 875- 750 см-1), Ch3- и Ch4-групп (2900, 2800, 1470, 1380, 720 см-1) и различных C-O связей (1740-1700, 1260, 1090 см-1) в контрольных и опытных образ- цах, которое было отчетливым в опытных образ- цах и слабым – в контрольных. В опытных образ- цах отмечено уменьшение значений спектральных коэффициентов K(I720/I1470) и C3(D720/D1380) и уве- личение значений спектральных коэффициентов C1(D1610/D720), C2(D750/D720) и K1(I750/I720), свиде- тельствующие о снижении доли н-парафиновых компонентов. После воздействия бактериального сообщества содержание н-алканов (Σn-C12-34) в нефти снизилось в 4.2 раза по сравнению с кон- тролем за счет деструкции, главным образом, низ- ко- и среднемолекулярных углеводородов, что не зависело от того, имели углеводороды четное или нечетное число атомов углерода. При этом наблю- далось значительное изменение в соотношении между н-алканами и нафтеновыми углеводорода- ми, а также н-алканами и изопреновыми углеводо- родами. По данным ИКС и ГЖХ, содержание н- алкильных структур под действием микроорга- низмов снизилось примерно в 4 раза. В то же вре- мя в контрольных образцах снижение содержания Схема биохимической очистки подземных вод
  • Использование аборигенной микрофлоры для борьбы с нефтяным загрязнением… 125 данных компонентов за счет действия физико- химических факторов не превышало 20%. В ре- зультате деятельности микроорганизмов в составе отдельных классов углеводородов нефти также произошли значительные изменения. Таким образом, исследования показали, что вы- деленное микробное сообщество способно исполь- зовать углеводороды нефти для поддержания своей жизнедеятельности и, следовательно, может быть использовано для интродукции в нефтезагрязнен- ные подземные воды Полазнинского нефтяного ме- сторождения с целью их биологической очистки. Данный консорциум может быть применен для очистки не только подземных, но и поверхностных и сточных вод. Его эффективность будет зависеть от конкретных (геохимических, литологических, гидродинамических) природных условий. Метод может быть использован как самостоятельный, так и как дополнительный к традиционным и повышать при этом эффективность очистки. Особый эффект данной технологии можно ожидать при очистке по- род от сорбированных нефтепродуктов в зоне се- зонного колебания уровня подземных вод. Следует отметить, что в подземных водах, за- грязненных большими дозами органических ве- ществ, создается восстановительная обстановка, вследствие чего деятельность аэробных окисляю- щих микроорганизмов становится невозможной. В таких случаях процессы естественного самоочи- щения идут за счет деятельности факультативно анаэробных и анаэробных микроорганизмов (Criddle, McCarty, Elliott et al., 1986, Lovley, 1997; Robertson, Bowman, Franzmann et al., 2001). Так, в подземных водах, загрязненных нефтью и нефте- продуктами, часто обнаруживают способные к их анаэробному окислению сульфатвосстанавливаю- щие бактерии (Coates, Woodward, Allen et al., 1997; Kropp, Davidova, Suflita, 2000; Robertson, Bowman, Franzmann et al., 2001; Townsend, Prince, Suflita, 2004). Поэтому ускорение естественного само- очищения таких подземных вод может быть дос- тигнуто активизацией деятельности анаэробного сульфатвосстанавливающего сообщества путем добавления дополнительных легкометаболизируе- мых микроорганизмами субстратов (например ор- ганических кислот или углеводов) (Kaiser, Bollag, 1990). Образующийся в процессе сульфатредукции сероводород будет мигрировать с током подзем- ных вод, окисляться до элементарной серы на окислительном геохимическом барьере и выпадать в осадок. В настоящее время на Полазнинском ме- сторождении авторами ведется разработка методов очистки нефтезагрязненных подземных вод за счет интенсификации деятельности анаэробных микро- организмов. Исследования выполнены при поддержке гран- та РФФИ №04-05-96039-р2004урал_а Список литературы Бузмаков С.А., Костарев С.М. Техногенные изме- нения компонентов природной среды в нефте- добывающих районах Пермской области. Пермь, 2003. 171 с. Горбунова К.А., Максимович Н.Г. Техногенное воздействие на закарстованные территории Пермской области. // География и природные ресурсы. 1991. № 3. С. 42–46. Квасников Е.И., Клюшникова Т.М. Микроорганиз- мы – деструкторы нефти в водных бассейнах. Киев: Наукова думка, 1981. 132 с. Коронелли Т.В. Принципы и методы интенсифи- кации биологического разрушения углеводоро- дов в окружающей среде // Прикл. биохим. и микробиол. 1996. Т. 32, № 6. С. 579–585. Максимович Н.Г., Казакевич С.В. Геоэкологические особенности Полазнинского месторождения нефти // Геология и полезные ископаемые За- падного Урала: Материалы регион. науч.-практ. конф. Пермь, 2004. С. 277–280. Морозов Н.В., Николаев В.Н. Влияние условий сре- ды на развитие нефтеразлагающих микроорга- низмов // Гидробиол. журн. 1978. Т. 14, № 4. С. 55–59. Caldwell M.E., Tanner R.S., Suflita J.M. Microbial me- tabolism of benzene and the oxidation of ferrous iron under anaerobic conditions: Implication for bioremediation // Anaerobe. 1999. Vol. 5. Р. 595– 603. Coates J.D., Woodward J., Allen J. et al. Anaerobic degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons and alkanes in petroleum-contaminated marine harbor sediments // Appl. Environ. Microbiol. 1997. Vol 63, iss 9. P. 3589–3593. Criddle C.S., McCarty P.L., Elliott M.C. et al. Reduc- tion of hexachloroethane to tetrachloroethylene in groundwater // J. Contaminant Hydrol. 1986. Vol. 1. Р. 133–142. Edwards E.A., Grbic-Galic D. Complete mineraliza- tion of benzene by aquifer microorganisms under strictly anaerobic conditions // Appl. Environ. Microbiol. 1992. Vol. 58. Р. 2663–2666. Elmen J., Pan W., Leung S.Y. et al. Kinetics of toluene degradation by a nitrate-reducing bacterium iso- lated from a groundwater aquifer // Biotech. Bio- eng. 1997. Vol. 55. Р. 82–90. Ghiorse W.C., Wilson J.T. Microbial ecology of the terrestrial subsurface // Adv. Appl. Microbiol. 1988. Vol. 33. Р. 107–172. Kaiser J.-P., Bollag J.-M. Microbial activity in the ter- restrial subsurface // Experientia. 1990. Vol. 46. Р. 797–806. Kleikemper J., Schroth M.H., Sigler W.V. et al. Activi- ty and diversity of sulfate-reducing bacteria in a petroleum hydrocarbon-contaminated aquifer // Appl. Environ. Microbiol. 2002. Vol. 68. Р. 1516– 1523. Kolbel-Boelke J., Anders E.-M., Nehrkorn A. Microbi-
  • 126 В. Т. Хмурчик, Н. Г. Максимович al communities in the saturated groundwater envi- ronment. II: Diversity of bacterial communities in a pleistocene sand aquifer and their in vitro activi- ties // Microb. Ecol. 1988. Vol. 16. Р. 31–48. Kropp K.G., Davidova I.A., Suflita J.M. Anaerobic oxidation of n-dodecane by an addition reaction in a sulfate-reducing bacterial enrichment culture // Appl. Environ. Microbiol. 2000. Vol 66, iss 12. P. 5393–5398. Lovley D.R. Microbial Fe(III) reduction in subsurface environments // FEMS Microbiol. Rev. 1997. Vol. 20. Р. 305–313. Robertson W.J., Bowman J.P., Franzmann P.D. et al. Desulfosporosinus meridiei sp nov., a spore- forming sulfate-reducing bacterium isolated from gasoline-contaminated groundwater // Int. J. Syst. Evolut. Microbiol. 2001. Vol. 51. Р. 133–140. Townsend T.G., Prince R.C., Suflita J.M. Anaerobic biodegradation of alicyclic constituents of gasoline and natural gas condensate by bacteria from an anoxic aquifer // FEMS Microbiol. Ecol. 2004. Vol. 49. P. 129–135. Поступила в редакцию 20.05.2006 Use of autochtonous microflora for purification of oil polluted ground water G.N. Maximovich, V.T. Khmurchik The remediation techniques of oil-polluted environments are observed. Authors tested the biotechnological method based on the usage of autochtonous microflora biopreparation to remediate ground water. The results of the test are discussed.

docslide.net

способ выделения деструкторов нефти и нефтепродуктов - патент РФ 2241745

Изобретение относится к области охраны окружающей среды и может быть использовано при восстановлении нефтезагрязненных земель. Способ включает отбор проб с нефтезагрязненной поверхности, селекцию углеводородокисляющих бактерий на жидкой минеральной среде с добавлением нефти с места загрязнения при температурах инкубирования +5°С, +15°С, +25°С и +35°С, отбор культур для пересева через 5, 10 и 15 дней, пересев полученных культур и дальнейшую наработку в отдельности всех отселектированных микроорганизмов в ферментерах при параметрах культивирования, оптимальных для выделенных микроорганизмов. Наработанными бактериальными препаратами на основе аборигенных микроорганизмов производят обработку нефтезагрязненного участка. Способ повышает вероятность поиска наиболее активных представителей углеводородокисляющей микрофлоры, утилизирующих углеводороды при низких положительных температурах, позволяет сократить затраты на производство биопрепарата. Использование данных биопрепаратов дает возможность начать обработку нефтезагрязненного участка рано весной и очистить участок от нефтяного загрязнения за один вегетационный сезон. 1 табл.

Углеводородокисляющие микроорганизмы широко распространены в природе и являются естественным компонентом почвенной системы.

Учеными и практиками постоянно ведется работа по выделению наиболее эффективных штаммов, способных деструктировать нефть и ее соединения.

Во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов имеется достаточное количество углеводородокисляющих бактерий, однако, их оптимальный температурный показатель для условий России высок - от +20 до +30°С, т.е. биопрепараты на их основе активно деструктируют углеводороды лишь в теплый период времени. При понижении температуры воздуха эффективность биопрепаратов резко падает, восстановительные работы на этом прекращаются. Поэтому для центральных, особенно северных районов России выделение нефтеокисляющих микроорганизмов, их селекция должна вестись в направлении не только высокой деструктивной активности, но и адаптации к пониженным положительным температурам и различным фракциям нефти.

В последнее время в технологиях восстановления нефтезагрязненных земель получило широкое распространение использование культуральной жидкости, основой которой являются аборигенные высокоэффективные углеводородокисляющие микроорганизмы.

Определяющим в этом направлении является способ выделения.

Б.Е.Чижов, В.И.Вавер, В.А.Долингер и др. (Лекции по рекультивации нефтезагрязненных земель в Ханты-Мансийском Автономном округе. Тюменский Государственный университет. - 2000. -С.64-65) предлагают источником посевного материала использовать разливы нефти на влажных почвах или мелкие непроточные водоемы умеренного уровня загрязнения давностью более 3 лет, на которых активное развитие нефтеокисляющей микрофлоры произошло спонтанно или в порядке проведения рекультивационных работ. В лаборатории из проб грунта, воды, отобранных в качестве источника посевного материала, на минеральной среде с добавлением нефти и нефтепродуктов выделяют аборигенные комплексы углеводородокисляющих микроорганизмов.

Основной недостаток данного метода выделения состоит в том, что эффективные штаммы углеводородокисляющих микроорганизмов выделяют из образцов сроком замазученности более 3 лет, хотя рекультивационные работы необходимо проводить сразу после аварии.

Маркарова М.Ю. (Использование углеводородокисляющих бактерий для восстановления нефтезагрязненных земель в условиях Крайнего Севера. Дисс. на соиск. уч. степени канд. биол.-хим. наук.- Сыктывкар, 1999. - с.44-45) предлагает выделение углеводородокисляющей микрофлоры проводить из загрязненной нефтью почвы путем пересева почвенной суспензии на свежую питательную среду. Навеску нефтезагрязненной почвы (100 г) помещают в 1-литровые колбы с 900 мл стерильной минеральной среды и инкубируют при t+10°C. Колбу периодически встряхивают. Через 40 суток производят пересев методом предельных разведений суспензии на питательную среду. Минеральную среду стерилизуют при 1 атм 1 час, разливают в чашки Петри и после застывания агара стерильным шпателем по поверхности растирают нефть по 1 мл на 1 чашку Петри. После прорастания на поверхности агара отдельных колоний микроорганизмов их рассеивают отдельно на чашки Петри на питательную среду.

Основной недостаток данного способа выделения нефтеусваивающих микроорганизмов - очень длительный срок инкубирования - 40 дней. Во-вторых, взят один температурный интервал - +10°С, хотя для условий северных регионов и для продолжения рекультивационных работ в условиях низких положительных температур, инкубирование желательно проводить при более низких температурах.

В качестве прототипа выбрано изобретение Власова С.А. и др. “Способ очистки почвы от нефти и нефтепродуктов” (патент РФ №2128703, С 12 N 1/26, В 09 С 1/10, 1999 г.). Из нефтезагрязненной почвы выделяют микроорганизмы, утилизирующие нефть, затем их нарабатывают в ферментерах и культуральной жидкостью обрабатывают место загрязнения.

Основной недостаток данного изобретения состоит в том, что выделение микроорганизмов начинается на твердой питательной среде, а стоимость МПА сейчас высокая, во-вторых, посев производят из разведений 10-3 и 10-4, в то время, как активные деструкторы могут остаться в первом и втором разведениях, в-третьих, не учитывается скорость появления колоний, в-четвертых, инкубирование проводилось при температуре 30°С, т.е. при понижении температуры воздуха данный биопрепарат будет терять свою активность.

Перечисленные недостатки были учтены в предлагаемом способе выделения эффективных деструкторов нефти.

Суть способа: производится отбор проб с нефтезагрязненной поверхности, затем ведется селекция углеводородокисляющих бактерий с последующим пересевом полученных культур и наработка в отдельности всех отселектированных микроорганизмов в ферментерах при параметрах культивирования, оптимальных для выделенных микроорганизмов. Селекция начинается на жидкой минеральной среде с добавлением нефти с места загрязнения, инкубирование ведется при различных температурах +5°С, +15°С, +25°С и +35°С, а отбор культур для пересева осуществляют через 5, 10 и 15 дней.

Ход выполнения работ: отобранные образцы просушиваются до воздушно-сухого состояния, выбираются мелкие камушки, растительные остатки. Готовится минеральная среда следующего состава: KNО 3 - 1 г, Kh3PO4 - 1 г, К2 НРO4 - 1 г, MgSO4 - 0,2 г, CaCl2 - 0,02 г, FeCl3 - 0,002 г, водопроводная вода до 1 литра. Один грамм пробы переносится в стерильную фарфоровую ступку, слегка увлажняется солевой средой и растирается до пастообразного состояния. Содержимое переносится в колбу объемом 750-1000 мм (ступку и пестик сполоснуть солевой средой, перенося остаток в ту же колбу). Общий объем смеси доводится до 100 мл. В колбу вносится 1 мл сырой стерильной нефти с конкретного места загрязнения. Колбы инкубируются при различных температурах:

- при +5°С для выделения психотолерантных активных деструкторов, осуществляющих разложение нефти и нефтепродуктов при низких положительных температурах;

- при +15°С для выделения эффективных аборигенных групп бактерий, активно усваивающих нефть в данном диапазоне температур;

- при +25°С для выделения термофильных микроорганизмов;

- при +35°С для выделения групп бактерий, размножающихся при высоких температурах воздуха.

Колбы периодически встряхивают. На 5-е, 10-е, 15-е сутки фиксируют видимые изменения среды (помутнение, пигмент) слоя нефти (дегазация, расслоение, изменение цвета, появление продуктов омыления и др.). Результаты лабораторных наблюдений показали, что колонии микроорганизмов, появляющиеся на пятый день, обладают повышенной интенсивностью образования биомассы клеток, и, как правило, время культивирования таких штаммов значительно ниже. В то же время деструктивные их свойства не всегда бывают высокими и особенно к нефти, содержащей высокий процент тяжелых фракций. Использование биологического препарата, состоящего преимущественно из бактерий, появившихся на пятый день, вполне оправдано, так как невысокие деструктивные показатели компенсируются высокой интенсивностью роста бактерий.

Колонии микроорганизмов, появившиеся на десятый день, в зависимости от вида культуры, обладают средними урожайными показателями, в этой ассоциации присутствуют в основном активные представители нефтедеструкторов, хорошо утилизирующие как легкие, так и средние фракции нефти.

Группы бактерий, появившиеся на пятнадцатый день, обладают медленным темпом роста, свои отселектированные свойства проявляют на тяжелых фракциях нефти, трудно поддающихся биологическому разложению.

Из колб с верхнего слоя пипеткой отбирают 0,5 см3 смеси и переносят в пробирку с 4,5 см3 солевой среды. Делается 2-3 последовательных десятикратных разведения на той же среде. Из каждой пробирки в 2-х повторениях проводится высев по 0,1 см3 на чашки с плотной средой. Пробы растираются шпателем на поверхности агара. Чашки инкубируют 3-5 суток при температурах: для психрофилов 22±2°C; для мезофилов 28±2°C; для термофилов 37±2°C. Чашки с посевом просматривают ежедневно. Проводят подсчет и описание морфологии колонии. Все выделенные колонии изолируют на питательный агар методом “истощающего штриха”. Чистоту выделенных культур проверяют визуально. Оценивают культурные свойства, характер роста колоний, их однотипность визуально и с помощью микроскопирования. Чистые бактериальные культуры с чашек отвиваются в пробирки со скошенным агаром, инкубируются 3-5 суток при соответствующих температурах. Выделенным представителям бактерий присваивают регистрационный номер, вносят в журнал. Затем проводят изучение основных биологических свойств, определяют их деструктивную активность.

Наработку бактериального препарата осуществляют на ферментере МФ-20 с заданными для каждой культуры оптимальными параметрами.

Применение этого метода для наработки бактериального препарата, состоящего из наиболее эффективных деструкторов нефти и нефтепродуктов, как экономически, так и экологически оправдано. Затраты на производство бактериального препарата на основе аборигенных микроорганизмов невысоки, а использование адаптированных к источнику загрязнения, почвенным и погодным условиям бактерий, разрушающих токсические вещества, делают этот метод абсолютно экономичным.

Предлагаемый метод, используемый для выделения эффективных деструкторов нефти, является составной частью “Технологии рекультивации нефтезагрязняющих земель на аварийных участках и полигонах способом активизации аборигенной микрофлоры”, утвержденной Министерством Природных Ресурсов Российской Федерации 21 февраля 2002 года №35-01-2/108. Положительное заключение Государственной экологической экспертизы утверждено приказом министра МПР России от 13.02.2002 г. №70; “Технологии рекультивации нефтезагрязненных земель способом активизации аборигенных микроорганизмов на лицензионных участках OOO “ЛУКОЙЛ-Западная Сибирь”, утвержденной Министерством Природных Ресурсов Российской Федерации 2 сентября 2002 года №552. Положительное заключение Государственной экологической экспертизы от 19 июля 2002 г; “Технология рекультивации загрязненных нефтью земель в зимний период с использованием аборигенных микроорганизмов деструкторов нефти”, утвержденной Министерством Природных Ресурсов Российской Федерации 2 сентября 2002 года №551. Положительное заключение Государственной экологической экспертизы от 19 июля 2002 г., разработанных ЗАО НПС “Элита-комплекс”.

Способ прошел практическую апробацию с высоким экономическим эффектом на площади более 3000 га.

Пример осуществления:

С нефтезагрязненного участка ЛПДС “Торгили” Тюменского УМН Сибнефтепровода осенью 2001 года были отобраны почвенные образцы. В микробиологической лаборатории по вышеописанной схеме были выделены психрофильные, мезофильные и термофильные аборигенные нефтеусваивающие бактерии. В марте 2002 года приготовлены бакпрепараты. При наступлении положительных температур воздуха нефтезагрязненный участок был обработан препаратом на основе психотолерантных микроорганизмов, через две недели была проведена повторная обработка этим препаратом. Результаты представлены в таблице. Третье опрыскивание препаратом на основе психрофильных деструкторов нефти проведено 15 мая. Перед обработкой препаратом, состоящим из мезофильных микроорганизмов - 1 июня, были отобраны почвенные образцы на содержание нефти и нефтепродуктов. Использование психрофильных нефтеразлагающих бактерий позволило к этому времени разложить 85% нефти и нефтепродуктов, в то время как в контроле их количество снизилось незначительно - со 194,7 до 173,2 г/кг. Четвертая обработка нефтезагрязненного участка была проведена препаратом на основе мезофилов и к 1 июля участок был очищен на 93,8%. Проведения последующих обработок на основе термофилов не потребовалось, так как участок был готов к посеву трав.

Таким образом, использование психрофильных нефтеусваивающих микроорганизмов позволило начать рекультивационные работы в ранние весенние месяцы и за один вегетационный сезон очистить участок от нефтяного загрязнения.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ выделения деструкторов нефти и нефтепродуктов, включающий отбор проб с нефтезагрязненной поверхности, селекцию углеводородокисляющих бактерий с последующим пересевом полученных культур и дальнейшую наработку в отдельности всех отселектированных микроорганизмов в ферментерах при параметрах культивирования, оптимальных для выделенных микроорганизмов, отличающийся тем, что селекцию начинают на жидкой минеральной среде с добавлением нефти с места загрязнения, инкубирование ведут при различных температурах +5°С, +15°С, +25°С и +35°С, а отбор культур для пересева осуществляют через 5, 10 и 15 дней.

www.freepatent.ru

Диссертация на тему «Микроорганизмы нефтяных пластов и использование их в биотехнологии повышения нефтеотдачи» автореферат по специальности ВАК 03.00.07 - Микробиология

1. Розанова Е.П., Назина Т.Н. Мезофильная палочковидная бесспоровая бактерия, восстанавливающая сульфаты. Микробиология. 1976. Т. 45. N. 5. С. 825-830.

2. Назина Т.Н., Розанова Е.П. Термофильные сульфатвосстанавливающие бактерии из нефтяных пластов. Микробиология. 1978. Т. 47. С. 142-148.

3. Назина Т.Н., Розанова Е.П., Калининская Т.А. Фиксация молекулярного азота сульфатвосстанавливающими бактериями из нефтяных пластов. Микробиология. 1979. Т. 48. N. 1. С. 133-136.

4. Назина Т.Н., Пивоварова Т.А. Субмикроскопическая организация и спорообразование у Desulfotomaculum nigrificans. Микробиология. 1979. Т. 48. N. 2. С. 302-306.

5. Розанова Е.П., Назина Т.Н. Распространение термофильных сульфатвосстанавливающих бактерий в нефтяных пластах Апшерона и Западной Сибири. Микробиология. 1979. Т. 48. N. 6. С. 1113-1117.

6. Назина Т.Н., Розанова Е.П. Экологические условия распространения метанобразующих бактерий в нефтяных пластах Апшерона. Микробиология. 1980. Т. 49. N. 1. С. 123-129.

7. Назина Т.Н. Образование молекулярного водорода под воздействием пластовой микрофлоры на нефть. Микробиология. 1981. Т. 50. С. 163-166.

8. Розанова Е.П., Назина Т.Н. Распространение сообщества сульфатвосстанавливающих бактерий в нефтяных месторождениях Апшерона. Микробиология. 1981. Т. 50. N. 3. С. 566-570.

9. Розанова, Е.П., Назина Т.Н. Углеводородокисляющие бактерии и их активность в нефтяных пластах. Микробиология. 1982. Т. 51. С. 342-348.

10. Назина Т.Н. Анаэробная микрофлора терригенных нефтяных пластов. Автореф. дис. канд. биол. наук. М. ИНМИ РАН. 1983; 24 с.

11. Назина Т.Н. Сообщества метанобразующих бактерий из нефтяных пластов Апшерона. Микробиология. 1984. Т. 53. N. 1. С. 149-155.

12. Розанова Е.П., Назина Т.Н. Разложение ацетата бинарной синтрофной ассоциацией, включающей сульфатвосстанавливающие бактерии. Микробиология. 1985. Т, 54. N. 3. С. 497-499.

13. Розанова Е.П., Назина Т.Н., Кулик Е.С., Сомов Ю.П. Микробиологическое образование метана из гексадекана. Микробиология. 1985. Т. 54. N. 4. С. 555-559.

14. Кузнецов С.И., Саралов А.И., Назина Т.Н. Микробиологические процессы круговорота углерода и азота в озерах. М:Наука. 1985. С. 29-103.

15. Nazina T.N. Rozanova Е.Р., Kuznetsov S.I. Microbial oil transformation processes accompanied by methane and hydrogen-sulfide formation. Geomicrobiology J. 1985. V. 4. N. 2. P. 103-130.

16. Назина Т.Н., Полтараус А.Б., Розанова Е.П. Оценка генетического родства палочковидных неспороносных сульфатвосстанавливающих бактерий. Микробиология. 1987, Т. 56. N. 5. С. 845-848.

17. Nazina T.N. Microbial oil transformation processes accompanied by methane and hydrogen-sulfide formation. In abstracts of the 8th International Symposium on Environmental Biogeochemistry, Nancy, France. 1987. P. 7.

18. Назина Т.Н., Розанова Е.П., Беляев C.C., Иванов М.В. Химические и микробиологические методы исследования пластовых жидкостей и кернов нефтяных месторождений. 1988. Пущино. НЦБИ АН СССР, Пущино: 25 с.

19. Розанова Е.П., Назина Т.Н., Галушко А.С. Выделение нового рода сульфатвосстанавливающих бактерий и описание нового вида этого рода Desulfomicrobium apsheronum gen. nov., sp. nov. Микробиология. 1988. Т. 57. N. 4. С. 634-641.

20. Назина Т.Н., Иванова А.Е., Канчавели Л.П., Розанова Е.П. Новая спорообразующая термофильная метилотрофная сульфатвосстанавли-вающая бактерия Desulfotomaculum kuznetsovii sp. nov. Микробиология. 1988. Т. 57. N. 5. С. 823-827.

21. Розанова Е.П., Назина Т.Н. Развитие углеводородокисляющих бактерий в моделях нефтяного пласта и возникновение агентов вытеснения нефти. Там же. Т. III. Разработка и эксплуатация. С. 426-434.

22. Розанова Е.П., Назина Т.Н. Сульфатвосстанавливающие бактерии (систематика и метаболизм). Успехи микробиологии. М.: Наука, 1989. Т. 23. С. 191-226.

23. Розанова Е.П., Назина Т.Н. Современные представления о сульфатвосстанавливающих бактериях. В сб. «Хемосинтез» к 100-летию открытия С.Н. Виноградским. Ред. М.В. Иванов. М.:Наука. 1989. С. 199-228

24. Rozanova Е.Р., Nazina T.N., Galushko A.S., Ivanova A.E. Sulphidogenic processes in water-flooded oil strata. Abstracts of 9th International Symposium on Environmental Biogeochemistiy, 1989. Moscow, USSR. P. 190.

25. Nazina T.N., Ivanova A.E., Borzenkov I.A., Charakhchian I.A., Belyaev S. S. Biogeochemical processes in high-temperature oil fields. Proc. Conf. on microbiology in the oil industry and lubrication. Hungary. 1991. P. 185-192

26. Назина Т.Н., Иванова A.E., Благов A.B. Микробиологическая характеристика нефтяных пластов полуострова Мангышлак. Микробиология. 1992. Т. 61. N. 2. С. 316-322.

27. Назина Т.Н., Иванова А.Е., Митюшина Л.Л., Беляев С.С. Термофильные углеводородокисляющие бактерии из нефтяных пластов. Микробиология. 1993.T.62.N. 3. С. 583-592.

28. Осипов Г.А., Назина Т.Н., Иванова А.Е. Изучение видового состава микробного сообщества заводняемого нефтяного пласта методом хромато-масс-спектрометрии. Микробиология. 1994. Т. 63. N. 5. С. 876-882.

29. Назина Т.Н., Иванова А.Е., Голубева О.В., Ибатуллин P.P., Беляев С.С., Иванов М.В. Распространение сульфат- и железоредуцирукмцих бактерий в пластовых водах Ромашкинского нефтяного месторождения. Микробиология. 1995. Т. 64. N. 2. С. 245-251.

30. Назина Т.Н., Иванова A.E., Ивойлов B.C., Миллер Ю.М., Ибатуллин P.P., Беляев С.С., Иванов М.В. Микробиологическая и геохимическаяхарактеристика карбонатных нефтяных коллекторов Татарии. Микробиология. 1998. Т. 67. N. 5. С. 694-700.

31. Турова Т.П., Назина Т.Н., Полтараус А.Б., Осипов Г. А. Филогенетическое положение и хемотаксономические характеристики сульфатвосстанавливающих бактерий рода Desulfomicrobium. Микробиология. 1998. Т.67. N. 6. С. 799-806.

32. Nazina T.N., Xue Y-F., Wang X-Y. Occurrence of thermophilic microorganisms in high-temperature Liao He oil field and their biotechnological potential. Intern. Conf. Thermophiles'98. 6-11 Sept. 1998. Brest, France. Programme&Abstracts/resumes. BT-P21.

33. Иванов М.В., Беляев С.С!7 Розанова Е.П., Мац А.А., Уваров Г.Н., Скрябин Г.К., Сургучев М.Л., Муслимов Р.Х., Розенберг М.Д., Борисов Ю.П., Лауринавичус К.С., Образцова А.Я., Бондарь В.А., Вагин В.П., Зякун

34. М., Назина Т.Н., Путилов М.Ф. Способ разработки заводненной нефтяной залежи. АС 1483944. 11.06.87.

35. Wagner М., Ziran В., Iwanow M.W., Beljajew S.S., Nazina T.N. Verfahren zur Unterdruckung sulfatreduzierender Bakterien bei MIOR. Deutsches Patentamt DE 41 27 744 Al. 25.2.93.• •

www.dissercat.com