ассоциация штаммов бактерий, продуцирующих биоэмульгаторы, для деградации нефти и нефтепродуктов в почвах, пресной и морской воде. Бактерии для нефти


Штамм бактерий acinetobacter species, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов

 

Использование: микробиология, а также очистка загрязненных водоемов и почв. Сущность изобретения: касается нового штамма бактерий, который выделен из мазута М-40. Штамм бактерий Acinetobacter species HB-1 утилизирует нефть и нефтепродукты в течение 14 суток на 65 - 75% при загрязнении 5 - 10 г/л. 1 табл.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается штамма бактерий, который может быть использован для очистки воды и почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами.

Известен штамм Pseudomonas aeruginosa 121, утилизирующий октан (коллекция музея лаборатории внехромосомной наследственности ИБФМ АН СССР, 1976). Недостатком штамма является узкий спектр утилизируемых нефтепродуктов. Такой же избирательностью обладает известный штамм Pseudomonas aeruginosa 123, несущий плазмиды Oct, Nah, Cam (a.c. N 612958, кл. C 12 N 15/09, 1978). Известен штамм Pseudomonas aeruginosa PAO, содержащий плазмиды Cam, Oct, Nah, Sal, контролирующий утилизацию отдельных углеводородов из состава нефти (патент США N 3813316 кл. 195-28, 1974). Недостатком вышеупомянутого штамма является низкая скорость утилизации сырой нефти. Недостатком штамма Pseudomonas putida 36 (a.c. N 1076446, кл. C 12 N 15/00, 1984), является то, что он растет и утилизирует нефть при достаточно высокой температуре (30oC). Процент утилизации нефти у Pseudomonas putida 36 cоставляет 68 74% за 30 суток. Задачей изобретения является получение штамма бактерий, способного осуществлять деградацию нефти и нефтепродуктов, который может быть использован при очистке водоемов, загрязненных нефтью и ее продуктами, при очистке почв, загрязненных мазутом. Поставленная задача решается получением штамма бактерий, утилизирующего нефть и нефтепродукты при различных диапазонах температуры и в более короткие сроки. Штамм бактерий Acinetobaster sp HB выделен из мазута М-40 и депонирован в Центральной коллекции микроорганизмов Государственного концерна "Биопрепарат" ЦКМК "Б" под номером ЦКМ В-56 Б. Предлагаемый штамм имеет следующие культурально-морфологические признаки: грамотрицательные аэробные коккобациллы 1,0 1,5 х 1,5 2,0 мк, неподвижны. В первые часы роста (до 18 часов) имеет вид коккобацилл, через сутки в основном наблюдаются кокковые формы клеток. На протных питательных средах общего назначения (МПА) через сутки образуются округлые колонии 2 6 мм, выпуклые, ровные края, маслянисто-слизистой консистенции, бесцветные. В бульоне бактерии растут в виде однородной мути с придонным осадком. Культура хорошо растет на минеральных средах (Е-8) с добавлением 0,5 1,0% нефтепродуктов. Для получения накопительной культуры в среду с рН 5,5 6,0 вносят 0,2% ацетата натрия. Физиологические признаки: аэроб, возможен рост в диапазоне температур от 10oC до 41oC, оптимальная температура 30oC, оптимальная кислотность среды 7,0, но возможен типичный рост при рН 5,5 8,0. Биохимические признаки. Использует глюкозу, галактозу, ксилозу, арабинозу, не усваивает мальтозу, рамнозу, сахарозу, маннозу, глицерин, инозит, маннит. В качестве источника углерода может использовать цитрат, сукцинат. Денитрификация отсутствует, фенилаланин не дезаминирует, желатин и крахмал не гидролизует, обладает уреазной активностью, каталазоположительная, оксидазоотрицательная. Отношение к углеводородам: использует парафин, вазелин, дизельное топливо, керосин, мазут (М-40 и М-100), гексадекан. При культивировании в дополнительных факторах роста не нуждается. Штамм невирулентный и нетоксичный, относится к микроорганизмам IV класса опасности (малоопасны). Устойчив к пенициллину. Оценку биодеградации нефти и нефтепродуктов проводили измерением веса сухого остатка. Условия хранения. В лиофилизованном виде в ампулах при температуре 4oC. Пример 1. Исследуют нефтеокисляющую активность Acinetobacter sp HB-1 в отношении сырой неочищенной нефти, дизельного топлива и мазута (М-40). В аналогичных условиях исследуют Pseudomonas putida 36 (штамм выделен из препарата путидойл). Acinetobacter sp HB-1 выращивают на минеральной среде Е-8 следующего состава: (г/л) (Nh5)2 HPO4 1,5, Kh3PO4 - 0,7, MgSO4 7h3O 0,8, NaCl 0,5, h3O дистиллированная до 1,0 л, рН 7,0. Добавка нефти или нефтепродуктов в качестве единственного источника углерода 0,5% (1,0%). В колбу V 100 см3 вносили 20 см3 среды Е-8 и 100 мг (200 мг) углеводорода (указанного выше) и 2,2 107 мкл/см3. Культивируют в первые сутки на качалке при комнатной температуре (18oC), 100 об/мин, затем в последующие 13 суток колбы инкубируют при комнатной температуре без принудительного встряхивания, т.е. в стационарных условиях. В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, углеводородом и без бактерий для определения общих (естественных) потерь. По истечении 14 суток проводят анализ всех проб. Культуральную жидкость экстрагируют хлороформом, биомассу клеток удаляют, остаток нефти и нефтепродуктов высушивают до постоянного веса. Сравнивая "сухой" вес остатка нефти в контроле и опытных пробах, находят процент утилизации нефти ( см.табл.). Как видно из таблицы, утилизирующая способность штамма Acinetobacter sp HB-1 по испытанным нефтепродуктам выше, чем Pseudomonas putida 36 при температуре 18 20oC, особенно в отношении мазута в 6,5 7,5 раз. Пример 2. Была проведена экспериментальная проверка эффективности штамма Acinetobacter sp HB-1 для очистки территории Бахметьевского промысла площадью 0,5 га, загрязненной нефтью. Испытание проводили с сентября 1992 г. по май 1993 года. Культуральную жидкость разбрызгивали на поверхность загрязненного водоема (23,46% исходный уровень нефтяного загрязнения водоема). Спустя два месяца после обработки визуальное наблюдение показало существенное уменьшение загрязненного участка отсутствие сплошной нефтяной пленки, остались лишь нефтяные пятна небольших размеров. Данные химического анализа свидетельствовали о значительном снижении, в 390 раз, уровня нефтяного загрязнения (0,06%). Анализ состояния обработанного участка в мае 1993 года свидетельствовал о полной очистке от нефти. Содержание нефтяных углеводородов в пробах воды и почвы составляло в среднем менее 1 мг в расчете на 1 л(кг) менее 0,0001% что не превышает ПДК для нефти в водоемах. Полученные результаты указывают на перспективность предлагаемого штамма бактерий, возможность создания на его основе препарата для биологической очистки территорий, загрязненных нефтью и нефтепродуктами.

Формула изобретения

1 Штамм бактерий Acinetobacter species ЦКМК "Б" ЦКМ В-56 Б, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов.

РИСУНКИ

Рисунок 1

www.findpatent.ru

Бактерии, питающиеся нефтепродуктами, могут помочь очистить загрязнения и разливы

Ферменты, продуцируемые бактериями вида Alcanivorax borkumensis, очищают почву, загрязненную нефтепродуктами, простым, эффективным и экологически безопасным способом

При загрузке из трубопроводов морских нефтедобывающих платформ в танкеры, неизбежно происходят разливы нефти, и их воздействие на окружающую среду вызывает озабоченность. К тому же, с завидной регулярностью происходят катастрофы с самими танкерами, что приводит к большим проблемам, связанных с дезактивацией и требующих значительных затрат времени и ресурсов.

Но каким бы распространённым и серьёзным ни был ущерб, он может быть устранён раствором, полученным из микроскопических бактерий — Alcanivorax borkumensis — это бактерия, которая питается углеводородами. Команда канадских учёных из исследовательского центра сети Университета Квебека (INRS) провела лабораторные тесты, которые показывают эффективность ферментов, продуцируемых бактерией, для расщепления нефтепродуктов в почве и воде. Их результаты дают надежду на простой, эффективный и экологически чистый метод обеззараживания воды и почвы на участках разлива нефти.

В последние годы исследователи упорядочили геномы тысяч бактерий из различных источников. Учёные составили «технические данные» для многих бактериальных штаммов с целью найти идеального кандидата на грязную работу — очистку разливов нефти. Они сосредоточились на ферментах, которые бактерии производят, и на условиях, в которых бактерии развиваются.

Alcanivorax borkumensis, непатогенная морская бактерия, привлекла их внимание. Геном микроорганизма содержал коды ряда интересных ферментов и классифицируется как «углеводороднокластический» — как бактерия, которая использует углеводороды в качестве источника энергии. A. borkumensis присутствует во всех океанах и дрейфует с течением, быстро размножается в районах с высокой концентрацией нефтяных соединений, что частично объясняет естественную деградацию, наблюдаемую после некоторых разливов. Но её корректирующий потенциал не был оценен по достоинству.

А. borkumensis может похвастаться внушительным набором инструментов: во время своей эволюции бактерия научилась производить целый ряд специфических ферментов, которые расщепляют почти все химические соединения, которые содержатся в нефти. Среди этих ферментов выделяются ферменты гидроксилазы, они отличаются от тех, которые встречаются у других видов бактерий — эти ферменты намного эффективнее в расщеплении более устойчивых химических соединений.

Чтобы проверить действие очистителя, исследовательская группа выделила несколько ферментов и использовала их для обработки образцов загрязнённой почвы. Было установлено, что деградация углеводородов с использованием экстракта сырых ферментов достигает более 80 процентов для различных соединений. Этот процесс эффективен при удалении бензола, толуола и ксилола и был испытан в нескольких разных условиях, чтобы показать, что он является мощным способом очистки загрязнённых почв и морской среды.

Следующие шаги для команды учёных — выяснить, как эти бактерии метаболизируют углеводороды и исследовать их потенциал для дезактивации. Одним из преимуществ подхода, разработанного в INRS, является его применение в труднодоступных средах, которые представляют собой серьёзную проблему при ликвидации разливов нефти.

ПОХОЖИЕ ЗАПИСИ

© Gearmix 2013 Права на опубликованный перевод принадлежат владельцам вебсайта gearmix.ru Все графические изображения, использованные при оформлении статьи принадлежат их владельцам. Знак охраны авторского права распространяется только на текст статьи. Использование материалов сайта без активной индексируемой ссылки на источник запрещено.

gearmix.ru

Удаление нефтепродуктов. Удаление нефти - Биопрепараты для очистных сооружений. Bioremove, Bi-Chem, Bacti-Bio. Бактерии для разложения жиров в жироуловителях и сточных водах канализации. Очистка сточных вод BioRemove Флокулянты Праестол Коагулянты Аква Аурат 30. wodaservice.ru

УДАЛЕНИЕ НЕФТЕПРОДУКТОВ

Биопрепараты для удаления загрязнений от проливов нефтепродуктов.

BI-CHEM® ABR SurfClean C3 - удаление проливов нефтепродуктов с асфальта, бетона, скальных поверхностей и почв.BI-CHEM® ABR Gazoline Blend - удаление "легких" фракций нефтепродуктов(бензин, керосин, солярка)BI-CHEM® ABR Nydrocarbon Blend - удаление "тяжелых" фракций нефтепродуктов(сырая нефть, гудрон, битум)BI-CHEM® Bi-Chem CWL -удаление нефтепродуктов из оборотной воды автомоек.BI-CHEM® XP 129+ биологическая мойка (без химии) деталей машин и механизмовBI-CHEM® ABR OBP- препарат для удаления нефтепродуктов с водной поверхности (биомешки).

Биопрепараты для удаления нефтепродуктов:

Би-ХемOBP (впитывающие мешки)Удаление нефтепродуктов из воды.

АВR SurfClinc3 ( жидкий, концентрат) Удаление пятен и розливов нефтепродуктов на асфальте, бетоне, скальныхп оверхностях и почвах.

ABR Gasoline blend (сухой,готовый к прим.)Удаление из почвы проливов нефтепродуктов легких фракций: бензин, солярка.

ABR Hydrocarbon blend (сухой,готовый к прим.)Удаление из почвы проливов нефтепродуктов тяжелых фракций (горючее, сырая нефть, битум).

Би-Хем DC 1002 CG (сухой,готовый к прим.)Очистка стоков вод промышленных предприятий, содержащих фенолы, креозот. Нефтеперегонные заводы, сталелитейные предприятия, заводы пластмасс и фармацевтические предприятия.

BI-CHEM® ABR SurfClean C3

Препарат для удаления пятен нефтепродуктов

Эффективное решение очистки асфальта, бетона, скальных поверхностей и почв от пятен углеводородов.Экологически безопасен - не оказывает вредного воздействия на человека и окружающую среду.Быстрое действие и продолжительный эффект от применения.Эффективен в удалении различных пятен углеводородов(минеральные и синтетические составляющие).При попадании в сливные коллекторы и канализацию удаляет из них нефтепродукты

Преимущества применения

Как очиститель работает эффективнее традиционных химических средств.Экологически безопасный продукт.Не требует применения дистиллятов и растворителей.Обеспечивает быстрый чистящий эффект.Оказывает продолжительное воздействие - удаляет даже старые и въевшиеся в поверхности пятна нефтепродуктов.При попадании в канализацию способствует разложению в ней нефтепродуктов.

BI-CHEM® XP 129+

Препарат для чистки деталей машин и механизмов.

Разработан как альтернатива сильным химическим средствам для очистки деталей автомашин и их частей от нефтепродуктов ,и обезжиривания .Безвреден для окружающей средыЭффективен в применении (быстро отмывает детали машин и механизмов).Экономичен (концентрированный продукт).Уникальная, запатентованная формула продукта.Снижает загрязненность сточных вод. Не требуется дополнительных затрат на очистку стоков.

BI-CHEM® CWL

Препарат для очистки оборотной воды и моечного оборудования автомоек.

wodaservice.ru

биосорбент для очистки водоемов от нефтепродуктов на основе штаммов бактерий и дрожжевых грибов - патент РФ 2318736

Изобретение относится к нефтяной промышленности и экологии и может быть использовано для очистки поверхности природных и искусственных водоемов, сточных вод и жидких отходов производств от загрязнений нефтью и нефтепродуктами с одновременной утилизацией загрязнения микроорганизмами. Биосорбент включает нефтеокисляющие микроорганизмы, а именно биомассу штамма бактерий Rhodococcus erythropolis HK-16 или Arthrobacter sp.HK-15 или дрожжевого гриба Candida lipolytica КБП-3308 или Candida guilliermondii КБП-3175, или Pichia guilliermondii КБП-3205, или их бактериально-дрожжевого консорциума, иммобилизованного в гидрофобный сорбент нефти на основе торфа путем обрастания сорбента бактериями и/или грибами. Изобретение позволяет осуществлять одновременно сорбцию и утилизацию нефти и нефтепродуктов с водной поверхности за счет применения штаммов бактерий и дрожжевых грибов, способных к иммобилизации на гидрофобном сорбенте и характеризующихся высокой биодеструкционной активностью при ликвидации интенсивных (более 40% нефти) загрязнений. 1 табл.

Изобретение относится к нефтяной промышленности и экологии и может быть использовано для очистки поверхности природных и искусственных водоемов, сточных вод и жидких отходов производств от загрязнений нефтью и нефтепродуктами с одновременной утилизацией загрязнения микроорганизмами.

Известны гидрофобные сорбенты на основе торфа (патенты РФ №2116128, №2191067, №2201898, заявка №2003127857). Все гидрофобные сорбенты характеризуются высокой нефтеемкостью и плавучестью.

Известен гидрофобный органоминеральный нефтяной сорбент "СОРБОНАФТ" (ТУ 0392-001-55763877-2003). Сорбент получен по способу, описанному в патенте РФ №2214859.

Максимальная поглотительная способность сорбента составляет 650%, крупность частиц насыпного сорбента 0,2-3,0 мм.

Недостатком этого сорбента является то, что собранную с поверхности воды нефть необходимо либо отделять от сорбента, что требует дополнительных затрат, или утилизировать сорбент вместе с нефтью, что является экономически не выгодным.

Известен сорбент НАФТОКС для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов (патент РФ №2053205), выбранный нами за прототип, включающий аэробные нефтеокисляющие бактерии, взятые в эффективном количестве, и наполнитель в виде органического или минерального твердого субстрата, например торфа, дерновоподзолистой почвы, чернозема, торфяно-навозного компоста.

Недостатком этого биопрепарата является то, что применяемый субстрат не обладает гидрофобностью на поверхности воды.

Задачей изобретения является получение биосорбента, способного осуществлять одновременно сорбцию и утилизацию нефти и нефтепродуктов с водной поверхности за счет применения микроорганизмов, способных к иммобилизации на гидрофобном сорбенте и характеризующихся высокой биодеструкционной активностью при ликвидации интенсивных (более 40% нефти) загрязнений.

В этом состоит технический результат.

Технический результат достигается тем, что биосорбент для очистки водной поверхности от нефти и нефтепродуктов, включающий нефтеокисляющие микроорганизмы, взятые в эффективном количестве, и носитель, отличается тем, что в качестве носителя содержит гидрофобный нефтяной сорбент на основе торфа, в качестве нефтеокисляющих микроорганизмов - штаммы бактерий Rhodococcus erythropolis, Arthrobacter sp. или дрожжевые грибы Candida lipolytica, Candida guilliermondii, Pichia guilliermondii, или их бактериально-дрожжевой консорциум, иммобилизованный на нефтяном сорбенте, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

штаммы бактерий или  
дрожжевые грибы, или  
бактериально-дрожжевой консорциум 20-30
гидрофобный нефтяной сорбент на основе торфаостальное.

Штаммы бактерий (Rhodococcus erythropolis, Arthrobacter sp.) и дрожжевых грибов (Candida lipolytica, Candida guilliermondii, Pichia guilliermondii) не депонированы, хранятся в коллекции Института биологии КНЦ УрО РАН, дрожжевые культуры также хранятся на кафедре биологии почвы факультета почвоведения МГУ им. М.В.Ломоносова. Авторами разработки штаммам и грибам присвоены следующие обозначения:

Rhodococcus erythropolis - НК-16;

Arthrobacter sp. - НК-15;

Candida lipolytica - КБП-3308;

Candida guilliermondii - КБП-3175;

Pichia guilliermondii - КБП-3205.

Штаммы микроорганизмов получены путем их выделения из нефтепродуктов и нефтезагрязненных субстратов на питательных средах методом чередования накопительных и чашечных культур с обязательной проверкой чистоты (Литвиненко С.Н. Защита нефтепродуктов от действия микроорганизмов. - М.: Изд-во «Химия», 1977). Для выделения культур микроорганизмов применима среда следующего состава: КН2PO 4 - 2,5; Nh5NO3 - 5,0; MgSO4×7h3 O - 1,0; h3O - 1 л и нефть - 5,0 г. В случае твердых питательных сред добавляют 20 г агара на 1 л среды.

Микроорганизмы и их консорциум, как и биосорбент в целом, характеризуются как экологически нетоксичные. Экспериментальная оценка степени опасности препаратов проведена в соответствии с «Критериями отнесения опасных отходов к классу опасности для окружающей природной среды», утвержденными Приказом МПР России от 15 июня 2001 г. №511. Полученные результаты подтверждены двумя стандартными методами биотестирования с применением дафний («Определение токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по смертности и изменению плодовитости дафний Daphnia magna», ФР 1.1.39.2001-00-283) и водорослей («Определение токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по изменению уровня флуоресценции хлорофилла и численности клеток водорослей Scenedesmus quadricauda», ФР 1.1.39.2001-00-284). Испытания проводились в аккредитованной лаборатории экотоксикологического анализа почв факультета почвоведения МГУ (ЛЭТАП) (аттестат аккредитации №РОСС RU.0001.513050).

Rhodococcus erythropolis (HK-16) получен путем селекции из природных образцов нефтесодержащих почв 203-й скважины Усинского района Республики Коми. Идентифицирован Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина 13.04.01. Грамположительные бактерии образуют слизистые колонии кремового цвета на большинстве питательных сред. В молодых культурах преобладают прямые или слегка искривленные слабо ветвящиеся палочки, которые с возрастом распадаются до кокковидных форм.

Arthrobacter sp. (НК-15) выделен из нефтезагрязненной почвы 203-й скважины Усинского района Республики Коми в 1999 г. Грамотрицательные аэробные палочковидные бактерии образуют слизистые округлые колонии кремового цвета на МПА.

Candida guilliermondii (КБП-3176; НК-302) предоставлена авторами из коллекции микроорганизмов кафедры биологии почвы факультета почвоведения МГУ им. М.В.Ломоносова. Выделена в НИИ генетики промышленных микроорганизмов в 1990 г. из ароматических углеводородов. Колонии на среде сусла гладкие, серо-белые, мелкозернистые.

Pichia guilliermondii (КБП-3205; НК-303) предоставлена авторами из коллекции микроорганизмов кафедры биологии почвы факультета почвоведения МГУ им. М.В.Ломоносова, выделена в 1982 г. из имаго Aedes diantaeus. Томская область, п.Басандайка. Колонии на среде сусла гладкие, серо-белые, мелкозернистые.

Candida lipolytica (КБП-3308; НК-304, анаморфа - Yarrowia lipolytica) предоставлена авторами из коллекции кафедры биологии почвы факультета почвоведения МГУ им. М.В.Ломоносова, выделена в 1992 г. из пластовых вод Бондюжского нефтяного месторождения. Колонии на среде сусла гладкие, серо-белые, мелкозернистые.

Способ получения биосорбента включает иммобилизацию на нефтяном гидрофобном сорбенте дрожжевых грибов Candida lipolytica, Candida guilliermondii, Pichia guilliermondii и культур бактерий Rhodococcus erythropolis, Arthrobacter sp. в количестве от 10 до 50 процентов (по сухому весу) с последующей сушкой на воздухе. Биосорбент, содержащий не менее 20% микроорганизмов, наносят на нефтезагрязненную водную поверхность, при этом осуществляется одновременная биодеструкция адсорбированной нефти бактериально-дрожжевой ассоциацией.

Способ получения биосорбента и его свойства показаны на примерах. В качестве гидрофобного нефтяного сорбента на основе торфа использовали сорбент с торговым названием «СОРБОНАФТ».

В опыте предусматривалось иммобилизирование микроорганизмов в нефтяной сорбент, затем, после нанесения сорбента на нефтезагрязненную водную поверхность, определение степени деструкции ими адсорбированной сорбентом нефти.

В условиях лаборатории проведены испытания биосорбента с целью оптимизации процесса деградации нефти на загрязненных водных поверхностях. В соответствии с этим в первой части опыта сорбент обогащали микроорганизмами, во второй полученный биосорбентобогащенный микроорганизмами сорбент распыляли на водную поверхность с нанесенным на нее определенным количеством нефти.

I. В небольшие емкости (лотки) на дно наливали по 20 мл питательной среды (15% неохмеленное пивное сусло), 20 г сорбента «СОРБОНАФТ» помещали в лоток, затем сверху распределяли по 20 мл культуры микроорганизмов (м/о). Лотки помещали в небольшие полиэтиленовые мешочки для уменьшения испарения влаги. Рост микроорганизмов продолжался в течение 9 суток.

Использовали следующие м/о:

1. Pichia guilliermondii;

2. Candida lipolytica;

3. Candida guilliermondii;

4. Rhodococcus erythropolis;

5. Arthrobacter sp.;

6. Pichia guilliermondii + Candida lipolytica + Candida guilliermondii + Rhodococcus erythropolis + Arthrobacter sp.

Внешних признаков изменения массы сорбента не наблюдалось, хотя можно было заметить некоторое уплотнение массы сорбента. Через 9 дней была выполнена вторая часть опыта.

II. В чашки диаметром 19 см была налита вода, расстояние от края до уровня воды составило 1,5-2 см. На поверхность воды была налита нефть и затем были рассыпаны образцы биосорбента. Нефть сорбировалась в течение нескольких минут. Исходное содержание нефти составило 46%. После 27 суток опыта с поверхности воды биосорбент был собран и помещен в лотки для высушивания и дальнейшего анализа.

Под влиянием жизнедеятельности микроорганизмов происходит утилизация нефти. Определение остаточной нефти в сорбенте показало, что через две недели опыта бактерии (Rhodococcus erythropolis, Arthrobacter sp.) и дрожжевые грибы (Candida lipolytica, Candida guilliermondii, Pichia guilliermondii) способствовали деструкции нефти, снижение загрязнения произошло на 31,5% (при использовании Candida lipolytica), на 30% (при использовании Candida guilliermondii или Pichia guilliermondii) и на 35% и 33% в вариантах с Rhodococcus erythropolis и Arthrobacter sp.

Этот опыт был повторен с консорциумом (ассоциацией) вышеуказанных микроорганизмов (Rhodococcus erythropolis+Arthrobacter sp.+Candida lipolytica+Candida guilliermondii+Pichia guilliermondii).

В течение 9 суток биосорбент активно обрастал грибами, мицелий был хорошо заметен. В чашки диаметром 19 см на поверхность воды была налита нефть и на поверхность были рассыпаны образцы сорбента с микроорганизмами. Нефть сорбировалась около 1 ч. После 27 суток опыта с поверхности воды сорбент был собран и помещен в лотки для высушивания и дальнейшего анализа. В таблице 1 приведены химические свойства биосорбента после микробиологической трансформации нефтезагрязнения.

Как видно из таблицы 1, имело место заметное (на 30-41%) снижение уровня загрязнения биосорбентов нефтью как с препаратами на основе монокультур микроорганизмов, так и в их ассоциациях. За время опыта (27 суток) уровень загрязнения в биосорбенте с использованием комплекса микроорганизмов (Candida lipolytica + Candida guilliermondii + Pichia guilliermondii + Arthrobacter sp. + Rhodococcus erythropolis) снизился на 41%. С разрушением нефтезагрязнения и жизнедеятельностью микроорганизмов связано заметное накопление в сорбенте элементов-биогенов (азот, фосфор, калий).

По завершении опыта для определения количества микроорганизмов были взяты пробы воды под сорбентом и самого сорбента, остававшегося на водной поверхности. Количество микроорганизмов в воде под сорбентом незначительно, а в сорбенте - сплошной рост, что позволяет судить о сравнительно прочном закреплении дрожжевых грибов и бактерий на сорбенте, загрязненном нефтью, и, следовательно, о возможности их применения для деструкции нефти, собранной сорбентом на водной поверхности.

Последующая опытно-производственная проверка адсорбционной и нефтедеструкционной способности биопрепарата в полевых условиях (на водной нефтезагрязненной поверхности в Усинском районе Республики Коми) показала высокую сорбционную способность (1 часть биопрепарата:6 частей нефти) и заметное (на 51%) снижение уровня загрязнения нефти в биосорбенте за вегетационный период.

Пример.

Для получения биосорбента в качестве компонентов брали штаммы бактерий: Rhodococcus erythropolis НК-16 или Arthrobacter sp. HK-15 или дрожжевого гриба: Candida lipolytica КБП-3308 или Candida guilliermondii КБП-3175, или Pichia guilliermondii КБП-3205, или их бактериально-дрожжевого консорциума и гидрофобный нефтяной сорбент «СОРБОНАФТ». Осуществляли иммобилизацию штамма в сорбент путем обрастания по вышеописанному способу. По окончании процесса обрастания полученную фракцию высушивали и определяли количественное соотношение биомассы штаммов и гидрофобного сорбента. Содержание биомассы штамма, иммобилизованного в гидрофобный сорбент, и биодеструктивная активность полученных биосорбентов приведены в таблице 1.

Таким образом, биосорбент способен осуществлять одновременно сорбцию и утилизацию нефти и нефтепродуктов с водной поверхности за счет применения штаммов бактериально-дрожжевого консорциума, способных к иммобилизации на гидрофобном сорбенте.

Таблица 1
ВариантХимические показатели биосорбентаУбыль нефти, % Биомасса штамма, иммобилизованного в гидрофобный сорбент, %
pHазот гидролиз.фосфор калий
мг на 100 г в.с.в.
Candida lipolytica КБП-33084,598,4 7,614,8 31,525
Candida guilliermondii КБП-31756,70 6,96,812,8 30,024
Pichia guilliermondii КБП-32056,74 6,46,112,3 30,028
Rhodococcus erythropolis HK-166,10 7,07,217,9 35,020
Arthrobacter sp. HK-156,006,8 7,516,9 33,030
Candida lipolytica КБП-3308 + Candida guilliermondii КБП-3175 + Pichia guilliermondii КБП-3205 + Arthrobacter sp. HK-15 + Rhodococcus erythropolis HK-166,36 7,02,610,6 41,024

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Биосорбент для очистки водоемов от нефтепродуктов, включающий нефтеокисляющие микроорганизмы, взятые в эффективном количестве, и носитель, отличающийся тем, что в качестве носителя биосорбент содержит гидрофобный нефтяной сорбент на основе торфа, а в качестве нефтеокисляющих микроорганизмов - биомассу штамма бактерии - Rhodococcus erythropolis HK-16 или Arthrobacter sp.HK-15, или дрожжевого гриба Candida lipolytica КБП-3308 или Candida guilliermondii КБП-3175 или Pichia guilliermondii КБП-3205 или их бактериально-дрожжевого консорциума, иммобилизованного в гидрофобный сорбент нефти на основе торфа путем обрастания сорбента бактериями и/или грибами, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

биомасса штамма бактерий:  
Rhodococcus erythropolis HK-16 или 
Arthrobacter sp.HK-15 или 
дрожжевого гриба Candida lipolytica КБП-3308 или  
Candida guilliermondii КБП-3175 или 
Pichia guilliermondii КБП-3205 
или их бактериально-дрожжевого консорциума 20-30
гидрофобный сорбент нефти на основе торфаостальное

www.freepatent.ru

Тюменские ученые нашли новые бактерии для уничтожения разливов нефти

https://www.znak.com/2016-10-05/tyumenskie_uchenye_nashli_novye_bakterii_dlya_unichtozheniya_razlivov_nefti

Сотрудники кафедры криософии ТюмГУ Ольга Доманская, Любовь Огурцова и Наталья Полякова сообщили о результатах своей работы по поиску перспективных углеводородокисляющих микроорганизмов для очистки нефтезагрязненных территорий Сибири. Как сообщили Znak.com в пресс-службе Тюменского госуниверситета, в ходе исследования ученые выделили бактерии из отложений Западной Сибири и провели скрининг микроорганизмов, проявляющих нефтеокисляющую способность.

Выделенные ими микроорганизмы из мерзлых пород показали способность к уничтожению нефти в широком диапазоне температур. Образцы мерзлых пород отобраны в районах нефтедобычи на Мале: неподалеку от Тарко-Сале из скважин с глубин от 1,5 до 30,3 метра. Оценку способности микроорганизмов к деструкции нефти осуществляли в жидкой питательной среде с добавлением 1% нефти в качестве единственного источника углерода. Культивировали в течение 14 и 30 дней при температуре 28, 22 и 5 градусов Цельсия.

Ученый заявил, что из тюменской нефти можно синтезировать алмазы

Работа имеет практическую ценность: нефть и нефтепродукты относятся к числу наиболее распространенных загрязняющих веществ. Экологический ущерб приводит к снижению качества и продуктивности почв и даже выводу земель из сельхозоборота.

В материковой части России основная часть ресурсов нефти и природного газа сосредоточена в Сибири и на Дальнем Востоке. Самовосстановление и очищение природы от загрязненных нефтепродуктами территорий Сибири затруднены. Причины – суровая продолжительная зима, распространение мерзлых пород, повышенная концентрация солей и другие.

«Сейчас для очистки воды и почвы от нефтяных углеводородов применяются технологии с использованием биопрепаратов, основу которых составляют углеводородокисляющие микроорганизмы, – пояснила Любовь Огурцова. – Но их применение ограничено из-за короткого периода положительных температур, все препараты деструктируют нефтепродукты при среднесуточной температуре не ниже плюс 10 градусов». Результаты ученых ТюмГУ станут основой дальнейшего изучения и возможности использования полученных штаммов для очистки нефтезагрязненных территорий Сибири.

Читайте также

www.znak.com

ассоциация штаммов бактерий, продуцирующих биоэмульгаторы, для деградации нефти и нефтепродуктов в почвах, пресной и морской воде - патент РФ 2312891

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано при очистке почв, воды и морских акваторий от загрязнения нефтью и нефтепродуктами. Ассоциация штаммов бактерий Rhodococcus sp. ВКМ Ас-2532Д, Rhodococcus sp. BKM Ас-2533Д, Pseudomonas sp. BKM B-2387Д и Pseudomonas putida BKM В-2380Д, продуцирующих биоэмульгаторы, для биодеградации нефти и нефтепродуктов в почвах, пресной и морской воде. Использование ассоциации штаммов позволяет осуществлять деградацию нефти и нефтепродуктов при повышенной концентрации соли как при нормальной, так и при низкой температуре. 1 ил., 2 табл. ассоциация штаммов бактерий, продуцирующих биоэмульгаторы, для деградации нефти и нефтепродуктов в почвах, пресной и морской воде, патент № 2312891

Рисунки к патенту РФ 2312891

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для деградации нефти и нефтепродуктов, в частности углеводородов нефти, при очистке почв, воды и морских акваторий от загрязнения нефтью и нефтепродуктами.

Известен консорциум нефтеокисляющих микроорганизмов Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas ftuorescens ПИ-896, Micrococcus sp. ПИ Ку-1, Burkholderia caryophylli Jap-3, Serratia odorifera Jap-1, который используют в качестве биопрепарата для борьбы с загрязнениями почвы нефтью и нефтепродуктами (RU 2191643, кл. В09С 1/10, 27.10.2002).

Недостатком ассоциации является неспособность к деградации нефти и нефтепродуктов при температуре ниже 12°С.

Известен биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, включающий ассоциацию аэробных бактериальных культур Acidovorax delafleldii HT-1, Burkholderia caryophylii HT-4, Pseudomonas fluorescens biovar II HT-6, Citrobacter amalonaticus Ян-3-2, Pseudomonas fluorescens Ян-8-2, Serratia marcescens Ян-10-2 с титром живых клеток не менее 1010.

Недостатком ассоциации является неспособность к деградации нефти и нефтепродуктов в присутствии повышенной концентрации соли (3-5%).

Известна ассоциация, состоящая из R-диссоциантов штаммов Rhodococcus ruber ВКМ Ас-1513Д и Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-1514Д, осуществляющая деградацию углеводородов нефти в широком диапазоне солености (0,05-10%) (оптимальная соленость среды 3-5%) и температур (8-35°С) (оптимальная температура 25-27°С). Данная ассоциация составляет основу биопрепарата «Родер» (RU 2174496, кл. C02F 3/34, 10.10.2001).

Недостатком микроорганизмов является неспособность продуцировать биоэмульгаторы (поверхностно-активные вещества природного происхождения), которые повышают эффективность биодеградации трудноразлагаемых фракций нефти.

Известна ассоциация микроорганизмов, включающая следующие микроорганизмы Ralstonia eutropha B2 (FERM P-16672), Aureobasidium pullulans B10 (FERM P-16674), Ralstonia eutropha T23 (FERM P-16671), Burkholderia pyrrocinia T26 (FERM P-16669), Ralstonia eutropha ×3 (FERM P-16673), Burkholderia pyrrocinia ×4 (FERM P-16670), которая может применяться для очистки от нефти и нефтепродуктов загрязненных территорий (JP 11266858, 05.10.1999).

Недостатком ассоциации является способность к деградации только моноароматических углеводородов (толуол, ксилол, бензол), входящих в состав нефти и неспособность к деградации полиароматических углеводородов.

Задача данного изобретения состоит в получении ассоциации штаммов бактерий, продуцирующих биоэмульгаторы и способных к деградации нефти и нефтепродуктов в почве, пресной и морской воде при повышенной концентрации соли.

Технический эффект от использования предлагаемой ассоциации состоит в том, что деградация нефти и нефтепродуктов осуществляется при повышенной концентрации соли как при нормальной, так и при низкой температуре, кроме того, входящие в состав ассоциации штаммы бактерий продуцируют поверхностно-активные вещества (биоэмульгаторы).

Предлагается ассоциация бактерий родов Rhodococcus и Pseudomonas, включающая следующие штаммы бактерий Rhodococcus sp. BKM Ас-2532Д, Rhodococcus sp. BKM Ас-2533Д, Pseudomonas sp. BKM В-2387Д и Pseudomonas putida BKM В-2380Д, продуцирующие биоэмульгаторы, для биодеградации нефти и нефтепродуктов в почвах, пресной и морской воде.

Она предназначена для биодеградации нефти и нефтепродуктов в почвах, пресной и морской воде как при нормальной, так и при низкой температурах. Штаммы бактерий содержатся в ассоциации в равных количествах.

Штаммы бактерий, входящие в состав ассоциации, депонированы в Всероссийской коллекции микроорганизмов (BKM) под следующими номерами:

Rhodococcus sp. X5 - BKM Ас-2532Д,

Rhodococcus sp. S67 - BKM Ас-2533Д,

Pseudomonas sp. BS3962 - BKM В-2387Д,

Pseudomonas putida BS3961 - BKM В-2380Д.

Идентификация штаммов бактерий проведена путем определения частичной нуклеотидной последовательности генов 16S рРНК.

Микроорганизмы, входящие в состав ассоциации, чувствительны к следующим антибиотикам: ампициллин, тетрациклин, налидиксовая кислота, эритромицин, новобиоцин, стрептомицин, канамицин, клафоран, рифампицин, хлорамфеникол.

Штамм бактерий Rhodococcus sp. BKM Ас-2532Д выделен из сточных вод резинотехнического завода.

Культурально-морфологические признаки.

Грамположительные прямые, изогнутые палочки размером 0,7-0,8×1,6-2,8 мкм, часто культура распадается на кокковые формы. Культура неподвижна. На стандартных питательных средах (МПА, LB) через 48 часов образует мелкие, шероховатые колонии кремового цвета.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Растет в температурном диапазоне от 4°С до 30°С, оптимум 25°С. Оптимум рН для роста 6,0-8,0. Способен к росту в присутствии 3% NaCl. Оксидазный тест отрицательный. Каталазный тест положительный. Использует в качестве источника роста нефть, нефтепродукты и отдельные углеводороды нефти. В дополнительных факторах роста микроорганизм не нуждается.

Штамм бактерий Rhodococcus sp. BKM Ас-2533Д выделен из почвы с территории автозаправочной станции.

Культурально-морфологические признаки.

Грамположительные прямые, изогнутые палочки размером 0,7-0,8×1,6-2,8 мкм, часто культура распадается на кокковые формы. Культура неподвижна. На стандартных питательных средах (МПА, LB) через 48 часов образует мелкие, шероховатые колонии кремового цвета.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Растет в температурном диапазоне от 4°С до 30°С, оптимум 25°С. Оптимум рН для роста 6,0-8,0. Способен к росту в присутствии 3% NaCl. Оксидазный тест отрицательный. Каталазный тест положительный. Использует в качестве источника роста нефть, нефтепродукты и отдельные углеводороды нефти. В дополнительных факторах роста микроорганизм не нуждается.

Штамм бактерий Pseudomonas sp. BKM В-2387Д выделен из почвы, загрязненной креозотом.

Культурально-морфологические признаки.

Подвижные прямые или изогнутые палочки размером 0,8-0,9×1,5-3 мкм. На стандартных питательных средах (МПА, LB, King В) образует круглые колонии 2-3 мм в диаметре, плоские, гладкие, края слегка неровные, белые, непрозрачные.

Окраска по Граму и реакция по Граму методом Gregersen (1978) - грамотрицательные.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Хемоорганотроф. Не нуждается в факторах роста. Оксидазный тест положительный. Катапазный тест положительный. Образует флуоресцирующий пигмент. Не растет при +41°С. Не обладает способностью к денитрификации с образованием азота. Желатин не гидролизует. Крахмал не гидролизует. Использует в качестве единственного источника углерода глюкозу, глутамат, сукцинат. Использует в качестве источника роста углеводороды бензоат, салицилат, нафталин, фенантрен, нефть и дизельное топливо. Оптимум рН для роста 6,0-8,0. Способен к росту в присутствии 3% NaCl.

Генетические признаки.

Микроорганизм содержит конъюгативную плазмиду биодеградации ПАУ pNF142 размером 90 т.п.н. Наличие конъюгативной плазмиды, содержащей гены биодеградации ПАУ, способствует увеличению деградативного потенциала за счет распространения генов среди аборигенных микроорганизмов.

Штамм бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д выделен из очистных сооружений коксогазового комбината.

Культурально-морфологические признаки.

Подвижные прямые или изогнутые палочки размером 0,8-0,9×1,5-3 мкм. На стандартных питательных средах (МПА, LB, King В) образует круглые колонии 2-3 мм в диаметре, плоские, гладкие, края слегка неровные, белые, непрозрачные.

Окраска по Граму и реакция по Граму методом Gregersen (1978) - грамотрицательные.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Хемоорганотроф. Не нуждается в факторах роста. Оксидазный тест положительный. Каталазный тест положительный. Образует флуоресцирующий пигмент. Не растет при +41°С. Не обладает способностью к денитрификации с образованием азота. Желатин не гидролизует. Крахмал не гидролизует. Использует в качестве единственного источника углерода глюкозу, глутамат, сукцинат. Использует в качестве источника роста углеводороды бензоат, салицилат, нафталин, фенантрен, нефть и дизельное топливо. Оптимум рН для роста 6,0-8,0. Способен к росту в присутствии 3% NaCl.

Генетические признаки.

Микроорганизм содержит две плазмиды размером 100 и 50 тпн. Плазмида pBS1141 размером 100 тпн содержит гены биодеградации нафталина и фенантрена, конъюгативна и относится к Р9 группе несовместимости. Наличие конъюгативной плазмиды, содержащей гены биодеградации ПАУ, в штамме бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д способствует увеличению деградативного потенциала за счет распространения генов среди аборигенных микроорганизмов.

Плазмида pBS1142 размером 50 тпн является криптической и не содержит генов биодеградации.

Отобранные микроорганизмы, входящие в состав ассоциации, способны утилизировать дизельное топливо, нефть, мазут или полициклические ароматические углеводороды в качестве единственного источника углерода и энергии при температуре от 4°С до 32°С.

Изучение способности микроорганизмов к росту на нефти и дизельном топливе в присутствии 3% NaCl при 24°С и 4-6°С показало (Табл.2), что в присутствии 3% NaCl микроорганизмы лучше растут на нефти, чем на дизельном топливе при 24°С и 4-6°С, т.е. способны деградировать не только легкие, но и тяжелые фракции нефти.

При росте на гексадекане эти микроорганизмы продуцируют биоэмульгаторы, повышающие эффективность биоутилизации нефти и нефтепродуктов. Исследование степени деградации нефти в жидкой минеральной среде показало, что индивидуальные штаммы бактерий способны деградировать от 15% до 26% нефти при 24°С в течение 7-10 суток и от 28% до 47% при 4-6°С в течение 10-20 суток (см. чертеж).

Пример 1.

Штаммы бактерий выращивают в колбах Эрленмейера со 100 мл минимальной среды Эванса, содержащей (г/л): К2HPO 4 - 8,71 г; 5 М раствор Nh5Cl - 1 мл; 0,1 М раствор Na2SO 4 - 1 мл; 62 мМ раствор MgCl2 - 1 мл; 1 мМ раствор CaCl2 - 1 мл; 0,005 мМ раствор (Nh5)6Мо 7O24·4Н2 O - 1 мл; микроэлементы - 1 мл (состав микроэлементов, г/л: ZnO - 0,41 г; FeCl3·6Н 2O -5,4 г; MnCl2·4H 2O - 2 г; CuCl2·2H 2O - 0,17 г; CoCl2·О - 0,48 г; Н3ВО3 - 0,06 г; рН 7) с добавлением нефти до конечной концентрации 1,65% весовых. Инокулирование колб с нефтью проводят суспензией микроорганизмов (10 мл на 100 мл среды, посевная доза 1-5×10 7 кл/мл). После засева колбы помещают на круговую качалку (120 об/мин) и выращивают в течение 7-10 суток при температуре 24°С и в течение 10-20 суток при температуре 4-6°С.

В качестве контроля используют неинокулированную колбу со средой и нефтью. Степень деградации нефти определяют с помощью гравиметрического метода. У 4 отобранных микроорганизмов степень деградации нефти при 4-6°С выше (28-46%), чем при 24°С (15-26%).

Пример 2.

Культивирование ассоциации микроорганизмов и инокулирование выполняют как в Примере 1. Биомассу штаммов бактерий, входящих в состав ассоциации, берут в равных количествах из расчета, что посевная доза на колбу составляет 1-5×10 7 кл/мл. Культивирование ассоциации проводят при 4-6°С в течение 10, 20 и 30 суток. Степень деградации нефти, определяемая с помощью гравиметрического метода, составляет от 20% до 45%. Степень деградации нефти возрастает с увеличением продолжительности эксперимента до 30 суток. Полученные данные подтверждают предположение о том, что для более эффективной деградации нефти в жидкой минеральной среде необходимо увеличить время эксперимента до 30 сут.

Пример 3.

Эмульгирующую активность штаммов бактерий определяют визуально согласно методике Broderic and Cooney по четырехбальной шкале и по изменению оптической плотности супернатанта с гексадеканом согласно методике Cirigliano and Carman в нашей модификации. 1 мл культуры, выращенной на среде Эванса с гексадеканом, центрифугируют в течение 3 минут при 12000 об/мин на микроцентрифуге «Beckman» (США). Супернатант (1 мл) переносят в пробирки, добавляют 1 мл фосфатного буфера и 0,5 мл гексадекана. Содержимое пробирки перемешивают на миксере в течение 2 мин. В качестве контроля используют 0,5 мл гексадекана в 2 мл фосфатного буфера. Оценку поверхностной активности проводят по оптической плотности исследуемых образцов на спектрофотометре ФЭК-56М-У42 при длине волны 540 нм и толщине кюветы 0,5 см. Как видно из данных табл. 1, все исследованные микроорганизмы обладают высокой эмульгирующей активностью.

Анализ полученных результатов позволяет отнести большинство штаммов бактерий к эндотипу, т.е. продуцируемые ими биоэмульгаторы связаны с клеточной стенкой и оптическая плотность культуральной жидкости после центрифугирования в присутствии гексадекана была низкой. Штамм бактерий Rhodococcus sp. ВКМ Ас-2533Д можно отнести к экзотипу, т.к. штамм бактерий выделяет биоэмульгаторы в культуральную жидкость. Как видно из приведенных данных, наличие в среде 3% NaCl приводит к уменьшению эмульгирующей активности, проявляемой микроорганизмами.

Таким образом, предложена ассоциация из четырех психротрофных микроорганизмов, продуцирующих биоэмульгаторы и способных к деградации нефти и нефтепродуктов при повышенной концентрации соли как при нормальных, так и при пониженных температурах.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ассоциация штаммов бактерий Rhodococcus sp. BKM Ас-2532Д, Rhodococcus sp. BKM Ac-2533 Д, Pseudomonas sp. BKM В-2387Д и Pseudomonas putida BKM B-2380Д, продуцирующих биоэмульгаторы, для деградации нефти и нефтепродуктов в почвах, пресной и морской воде.

www.freepatent.ru