Биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов. Биопрепараты для нефти


Биопрепараты для очистки от нефти — доклад

Биопрепараты для очистки от нефти

ЗАО НПФ «Уралинвест» предлагает высокоэффективный сухой биопрепарат «ЛЕНОЙЛ СХП» (ТУ 9291-020-22657427-2004), предназначенный для ликвидации последствий загрязнения окружающей среды нефтепродуктами, производства ГУП «Опытный завод АН РБ» совместно с Институтом Биологии УНЦ РАН.

Все компоненты биопрепарата нетоксичны и штаммы микроорганизмов непатогенны, о чем свидетельствует Санитарно-эпидемиологическое заключение №2.Б.Ц.01.929.П.000621.06.04 от 15.06.2004 г.

Безопасность препарата для окружающей среды подтверждена Экологическим сертификатом соответствия рег.№ СЕР(454)-Г-ОС-46АБГ от 16 июня 2004 г.

«ЛЕНОЙЛ СХП» представляет собой порошок светло-кремового цвета содержащий активно утилизирующие нефть микроорганизмы в количестве не менее 1*108КОЕ/г.

Особая технология изготовления позволяет увеличить гарантийный срок хранения препарата до 24 месяцев со дня изготовления.

Биопрепарат «ЛЕНОЙЛ СХП» проявляет высокую эффективность как при рекультивации почв, так и при очистке замкнутых водоемов и резервуаров, в которых водная поверхность загрязнена нефтью или нефтепродуктами.

Микроорганизмы, входящие в состав препарата активно утилизируют нефтепродукты при температуре окружающей среды от +3°С.

Препарат «ЛЕНОЙЛ СХП» эффективен даже при высоком (от 30 до 45%) исходном уровне нефтяного загрязнения почвы.

Степень биодеградации нефти при ее исходном содержании в почве на уровне 10-30% при внесении биопрепарата «ЛЕНОЙЛ СХП» и необходимых добавок для оптимизации жизнедеятельности микроорганизмов составляет за 60 суток от 78 до 86%.

 

 Специалисты ЗАО НПФ "Уралинвест" совместно с ГУП «Опытный завод АН РБ» производят весь комплекс работ, связанный с разработкой, согласованием и осуществлением проекта ликвидации нефтяных загрязнений.

Учеными Уфимского научного центра РАН и ЮганскНИПИнефть была проведена сравнительная оценка эффективности биопрепарата для биоремедиации нефтезагрязненных почв по сравнению с известными коммерческими препаратами.

Изучали процесс биодеградации нефти и процесс биологической рекультивации загрязненных нефтью чернозема и торфа. Степень загрязнения составляла 10,20,30% (масс).

По эффективности разложения нефти при 10,20 и 30% степени загрязнения, как в торфе, так и в черноземе биопрепарат Ленойлзначительно превосходит аналогичные биопрепараты.

Исследования показали, что биопрепарат Ленойл, содержащий ассоциацию микроорганизмов (Bacillius brevis и Arthrobacter sp.) способен адаптироваться к высоким дозам нефти, эффективно утилизировать субстрат независимо от типа почвы и особенностей загрязнителя.

 

 Степень биодеградации нефти в почве и торфе (%) за 60 суток эксперимента.

Препарат

Степень загрязнения,%

Степень биодеградации нефти,%

почва

торф

Ленойл

10

85,3

84,3

20

70,2

66,9

30

47,9

45,0

 

Инструкция по применению биологического препарата «Ленойл-СХП» (сухая форма) ТУ 9291-020-22657427-2004

Биологический препарат «Ленойл-СХП» представляет собой порошок, состоящий из клеток микроорганизмов, обладающих углеводородокисляющей активностью и концентрацией не менее 109 клеток в грамме препарата (КОЕ/г).

Препарат, обладая высоковыраженной активностью в отношении углеводородов нефти и нефтепродуктов, переводит их в экологически нейтральные соединения и способствует ускорению рекультивации загрязненных объектов.

Объектами применения могут быть почвы и воды, загрязненные нефтью и нефтепродуктами. Использование препарата предусматривает оценку характера и количества загрязнений, выбор способа применения и, при необходимости, приготовления рабочей суспензии препарата.

Приготовление суспензии из сухого препарата:

5 кг сухого  препарата разводят в 100 л водопроводной  воды. Суспензию тщательно перемешивают. Для обеспечения бездефицитного  питания, необходимого для нормальной  жизнедеятельности микроорганизмов, входящих в препарат, в суспензию  вносят дизельное топливо (0,5%) и  азотофосфорные удобрения (500 г) с соотношением N: P2O5= 1: (2,5 : 5,0). Например, аммофос (ГОСТ 18918-85) в количестве 450 г. Рабочую суспензию препарата выдерживают 24 часа при температуре 20-25 °С, периодически перемешивая.

Готовую суспензию наносят из расчета 10 л на 1 кв.м при загрязнении до 15% и 20 л при загрязнении от 15 до 30%.

Препарат вносят в нефтезагрязненную почву 1 раз в сезон под поверхностную обработку (вспашка, рыхление, дискование) методом дождевания с помощью любых предназначенных для этого агрегатов. Обработку почвы можно осуществлять при среднесуточных температурах почвы от +3 до +40 °С.

 

 

   

Санитарно-эпидемиологическое заключение

 

Паспорт

 

Гигиеническая характеристика продукции

 

У нас большой опыт работы и обширный регион поставок биопрепаратов для очистки от нефти по всей России. Это города Санкт-Петербург, Ленинградская область, Москва, Московская область, Нижний Новгород, Екатеринбург, Тюмень, Самара, Челябинск, Новосибирск, Красноярск, Пермь, Казань, Краснодар, Ростов-на-Дону, Саратов, Омск, Астрахань, Волгоград.

http://www.ufa-uralinvest.ru/preparat.htm

 

 

 

 

 

Биопрепараты — деструкторы нефти и нефтепродуктов

Опубликовано 02.09.2012 автором АПК

В России под биопрепаратом чаще всего понимают препараты на основе штаммов микроорганизмов, которые получили все необходимые разрешительные документы, т.е. эти препараты безопасны с медицинских, санитарно-гигиенических и экологическихпозиций и не имеют противопоказаний для промышленной наработки. 

Комплекс мероприятий, завершающихся получением разрешения на использование биопрепарата, обычно включает в себя работы по таксономической идентификации штаммов-биодеструкторов (для микроорганизмов, выделенных из природных сред), токсико-гигиеническую оценку микробных препаратов, определение ПДК клеток в рабочей зоне (зоне применения препарата), составление паспорта на биопрепарат, получение сертификата на биопрепарат, удостоверяющего его медицинскую и эколого-гигиеническую безвредность. Биопрепараты на основе штаммов нефтеокисляющих микроорганизмовподразделяются на две основные группы: -    биопрепараты на основе монокультуры; -    биопрепараты, в состав которых входит несколько штаммов микроорганизмов. Монобактериальные препараты характеризуются более узкой специфичностью по отношению к индивидуальным углеводородам, более узким интервалом рН, оптимальным для активности микроорганизмов, а также интервалом солености, температуры, концентрации углеводородов. Полибактериальные препараты имеют более широкие адаптационные и экологические возможности для использования. Подбор микроорганизмов — деструкторов углеводородов, в том числе и в составе нефтей, не вызывает особых проблем. Они широко распространены в природе, причем в нашей стране накоплен особенно большой опыт работы с ними в связи с созданием на протяжении 60-70-х гг. крупнотоннажной промышленности по получению БВК из углеводородов нефти в качестве сырья. На отечественном рынке в последнее время появилось большое количество биопрепаратов для ликвидации загрязнений нефтью и нефтепродуктами, подтвердивших свою эффективность в различных условиях очистки и для различных нефтепродуктов, причем фирмы, занимающиеся проведением очистных ирекультивационных мероприятий считают для себя менее хлопотным и более выгодным налаживать выпуск собственного биопрепарата, чем покупать готовый на стороне. В этой связи необходимо отметить, что не все из испытывавшихся штаммов микроорганизмов-деструкторов обладали необходимыми разрешительными документами. Биопрепараты представляют собой массу жизнеспособных клеток микроорганизмов- биодеструкторов и различаются используемыми для их получения штаммами, которые характеризуются различными физиолого-биохимическими свойствами, такими как термотолерантность, осмофильность, оптимальные для роста значения рН, способность включать в метаболические процессы разные классы углеводородов и спектры налканов. Эти физиолого-биохимические свойства штаммов — биодеструкторов определяют эффективность применения биопрепаратов в разныхпочвенно-климатических зонах, для удаления определенных по химическому составузагрязнений. Как правило, все разработанные препараты предназначаются для уничтожениязагрязнения нефтью и нефтепродуктами не только почвы и грунта, но и пресных водоемов, акватории морей, стоков промышленных предприятий и загрязненных внутренних поверхностей технологических резервуаров и танков. Некоторые характеристики наиболее известных препаратов приведены в таблице 1

№ 

Препарат,

цена за кг

Действующее

начало

Условия работы

Нормы расхода

Срок очистки в оптим. условиях

Источник информации

1.

Путидойл,(разработка ЗапСибНИГНИ,г. Тюмень),29 $/кг

Pseudomonasputida

t°С +10 — +35, концентрациязагрязнений в почвене более 10% при глубине проникновенияне более  15 см; в воде не выше 20 г/л,толщина пленки нефти до 10 мм.

3-15 кг/га почвы, 3-5 г/м3 грунта,2-8 г/м3загрязн.емкости, 2-5 кг/га водной поверхности

1-2 мес,  2-3 нед. наспец.площадках,5-10 дней в емкости

А.с. 1428809опубл.07.10.88;инструкция по применению

2.

Деворойл,(разработкаИНМИ РАН, г. Москва)35 -45 $/кг

Ассоциация бактерий и дрожжей,   включающая липофильные и гидрофильныештаммы, с различным оптимумом рН ивысокой осмофильностью (до 120 г/л NaCl), медленнорастущие и быстрорастущие (Rhodococcus spp. — 3  штамма,Alcaligencs sp.,Jarrowia lipolytica и др.)

t°С +5 — +40, рН 4,5-9,5 загрязнение до20 кг/м2поверхностипочвы; окисляют н-алканы С9-С30,ароматические соединения — фенол, крезол, пирокатехин и др.

5-10 кг/га почвы, 1 кг/га поверхности водоема

1-2 мес.

А.с. 2023686опубл.30.11.94;инструкция по применению

3.

Биодеструктор — Валентис и др.,(разработкаГосНИИ-Синтезбелок. г. Москва)35-45 $/кг

AcinetobacterValentis

t°C +10 — +50, рН 6-8концентрация загрязнений не выше 20 кг/м2

10-15 кг/га почвы

1-2 мес.

Инструкция по применению

4

Деградойл

Azotobactervinelandii и др. микроорганизмы

t°C +10 -+35загрязнение до 20 г/кг почвы, широкаясубстратная специфичность

5-10 кг/га почвы

1-2 мес.

рекламная информация

5.

Олеоворин,Биоприн,(разработкаГосНИИ-Синтезбелок. г. Москва)35-45 $/кг

Acinetobacter oleovorum,дрожжи р. Candida

t°C +3 — +45. рН 3,5-10. загрязнение до 20 г/кг почвы

15 кг/га почвы, 10 кг/га поверхности воды

1-2 мес.

А.с. 1809822,опубл.15.04.93.А.с. 2007372опубл.15.02.94

 

 

6.

Эконадин,5-6 $/кг вместе сторфом

Pseudomonas fluorescens насфагновом торфе (около 10 мг клеток на 1 г торфа)

t°C +5 — +32 влажность торфане более 10%

30-50кг/ 100м2почвы,100-240

кг/м3нефти

3-4 мес. впочве, 2-4 нед. с поверхности воды

А.с.2033975опубл.30.04.95, А.с.2031860опубл.27.03.95

7.

Экойл,3,5-6 $/кг (сторфом),Экойл-М,Фежел-Био,(разработка ГНЦ   прикладной микробиологии, п.Оболенск Моск. обл.)

Pseudomonas sp. на модифицированномторфе, Acinetobactersp, Муcobacteriumflavescens. ассоциации микроорганизмов вжидком или лиофилизированном виде

t°C не ниже+5,загрязненность до 25 г/кг

30-50кг/ 100м2почвы,100 кг/м3нефти

3-4 мес. впочве, 1-2 мес. с поверхности воды

Рекламная информация

8.

Аллегро,(ГосНИИСинтезбелок)

на основе монокультуры

ароматические углеводороды

     

9.

Торнадо,(ГосНИИСинтезбелок)

на основе монокультуры

рН 6 — 8, пресные воды

     

10

Лидер,(ГосНИИСинтезбелок)

на основе монокультуры

морская вода изасоленные почвы

     

11.

Родер,(ГосНИИнефть, г.Москва)

на основе монокультуры

       

12

НХ7,(разработкаГосНИИГенетики, г.Москва)

Rhodococccus sp.

5-30 °C, рН 4.5-10, активен при невысоких положительных температурах (+5- + 18° С) и высоком содержании нефти в среде, работает в широком диапазоне солености среды,обладает широкой субстратной специфичностью, не требует предварительной активации перед использованием

10 кг/га почвы

1-2 мес.

Заявка N93041474от 25 августа 1993 г.

 

 

13.

Лестан,(Киевскийгосуниверситет пищевых технологий, Институт микробиологиии вирусологии НАН Украины, г. Киев)

бактериальный препарат на носителе с добавлением ПАВ в количестве 1-2 г ПАВ/л суспензии

Устойчив к замораживанию и нагреву. При обработке поверхностей препарат наносится в виде биопены.

 

Разложение 90% нефти в почвеза 30-40 дн.

Прикладная биохимия имикробиология.1996. т.32. N2, с.219- 223

14.

Рага-Вас,(фирма Miсго-Вас, США)

полибактериальный

       

15

Noggies NG20,(фирмаBiodetox)

применяется в видебиопены

для очистки от мазута

 

Степеньочистки 90% за 35 дней присодержании 8-9 г.мазута/ кг сухой почвы

Environ.Technol., 1990. v. 11, N5, р. 443-454

16

UNI-REM(фирма BioTech Service,США)

ферментный препарат

       

17

FуrеZyme,(фирмаEcotech International,США).

ферментный препарат

       

Препарат «Путидойл» появился первым в ряду биопрепаратов-нефтедеструкторов. Его действующим началом являлись бактерии Pseudomonas putida, обладающие по данным разработчиков высокой окислительной активностью в отношении углеводородов нефти прямой, разветвленной и циклической структур. Препарат получали путем высушивания выращенной бактериальной массы и использовали в виде взвеси бактериальных клеток (не более 0,2% к объему раствора) в 0,07%-ом растворе минеральных солей (аммофоса или диаммофоса).  Активирование препарата производилось выдерживанием суспензии при перемешивании и аэрации 4-18 ч. при t= 26-30°C. По результатам исследований и испытаний были определены расходные нормативы и выработаны рекомендации по использованию препарата «Путидойл» (таблица 2). Препарат «Деворойл» получен на основе консорциума микроорганизмов дрожжей и бак-терий Rhodococcus longus, Rhodococcus maris, Rhodococcus erythropolis, Alcaligenes sp., Pseudo-monas stutzeri, Jarrowia lipolytica, Candida sp., растущих на углеводородах различных классов и их производных, устойчивых к повышенной солености (до 150 г/л NaCl), к резким колебаниям температуры от +5 до +40°C, с активностью в широком диапазоне рН (от 4,5 до 9,5) при интенсивности загрязнения почвы нефтью более 5%. Высокая эффективность применения «Деворойла» по данным разработчиков определяется тем, что в состав препарата входят липофильные и гидрофильные микроорганизмы: бактерии, окисляющие нефтяные алканы с длиной углеродной цепи С9 — С30 и ароматические соединения, в частности фенол, крезол и пирокатехин; дрожжи, характеризующиеся высокой нефтеокисляющей активностью и способные выделять в среду аминокислоты, витамины и поверхностно-активные вещества. Используемые другими представителями почвенного биоценоза продукты жизнедеятельности бактерий и сами клетки отми-рающих бактерий легко усваиваются сапрофитной микрофлорой биоценоза. Испытание препарата на реальных объектах Западной Сибири, Татарстана и др. показало его высокую эффективность. Так, с его помощью за 3 недели было удалено 70% нефти с поверхности почвы при содержании нефти 20г/дм3 почвы. Препарат может быть использован для очистки от различных типов сырой нефти (высоко и низкопарафинистой, вязкой, с высоким содержанием серы и др.), мазута, дизельного топлива, бензина, керосина. Препараты серии «Биодеструктор», полученные на основе штаммов бактерий Acinetobac-ter valentis (препарат «Валентис»), Acinetobacter parapliinicum и Acinetobacter oleovorans (препарат «Олеоворин»), наиболее эффективны соответственно при температуре от +10 до +50 С и от +20 до +42°C при рН 6,5-7,2. Препараты получают путем высушивания на распылительной су-шилке биомассы бактерий Acinetobacter sp., выращенной на н-парафинах при t =20-42°C и рН=6,5-7,2. В одном из вариантов испытания препаратов наблюдалось снижение за 45 сут. концентрации загрязнений с 20 кг/м2 до 1 кг/м2. В другом варианте испытаний в загрязненном отстойнике наблюдалось исчезновение пленки нефти через 30 сут. при исходном содержанием нефти 10 кг/га поверхности отстойника. Основой препарата «Деградойл» является выделенная из почвы смешанная культура микроорганизмов, включающая азотфиксирующие бактерии Azotobacter vinelandii. По данным разработчиков препарат обладает широкой субстратной специфичностью. Бактерии окисляют углеводороды, а другие почвенные микроорганизмыметаболизируют продукты их окисления. Испытания препарата на загрязненных участках площадью 2,5 га показало, что при расходе препарата 6 кг/га и предварительной механической обработке за 49 сут. уровень загрязнения мазутом снижается с 20 г/кг до 2 г/кг в гумусовых почвах и 0,012 г/кг в глинистых почвах и песчаниках. Препараты «Эконадин» и «Экойл» получают путем выращивания бактериальной культуры Pseudomonas fluorescens до концентрации не менее 5 г/л по сухой биомассе, ее последующего флокулирования перекисью водорода и хлоридом кальция, иммобилизации сфлокулирован-ной биомассы бактерий на сфанговом торфе и высушивания торфа при температуре не более 30 С. Полученный препарат вносят на поверхность загрязненной водной среды в соотношении 0,1-0,24 г препарата на 1 мл нефтяного загрязнения. Количество клеток бактерий не менее 109 клеток на 1 г торфа(около 10 мг/г). При использование препарата «Эконадин» была показана возможность очистки поверхности воды и утилизации сорбированной торфом нефти за 6 суток в случае оптимальных условий. Применение торфяного препарата позволяет провести очистку и рекультивацию почвы за 4-8 мес. Отмечены также стимулирование роста и прибавка урожая растений при внесении препарата в незагрязненную почву. Препарат «Экойл» также позволяет провести очистку поверхности воды торфом с микроорганизмами с утилизацией сорбированной нефти в течение 2-х месяцев и провести очистку и рекультивацию загрязненной почвы за 4-8 мес. Как видно из приведенных данных, с помощью биопрепаратов в большинстве случаев удается очистить загрязненную среду за один летний сезон. Дальнейшее повышение эффективности применения препаратов для нефтеочистки почвы связывается, во-первых, с совершенствованием технологии их применения, в частности, с разработкой методов, повышающих степень высвобождения нефтепродуктов, сорбированных частицами почв, например, при добавлении ПАВ, специальных сорбентов, а также методов, обеспечивающих транспорт кислорода в системе, например, при обработке почвы перекисью водорода и т.п. Во-вторых, с совершенствованием технологии их получения, и в первую очередь с использованием новых, более активных штаммов биодеструкторов, и, в частности, с использованием бактерий, содержащих плазмиды, кодирующие включение углеводородов в метаболизм. Из данных, приведенных в таблицах 1 и 2, можно оценить удельные затраты на биопрепарат при различных вариантах очистки, которые составляют следующие величины (без учета технологических затрат на приготовление (активацию) биопрепарата непосредственно перед его использованием, обработку участка биопрепаратом, проведения необходимых для эффективной работы биопрепарата агротехнических мероприятий): 100-700 $/га почвы 30 — 150 $/га водной поверхности 0,1 -0,3 $/м3 грунта 0,2 — 1,5 $/м3 воды 40 — 250 $/м3 нефти (при очистке емкостей препаратом без носителя) 300 — 1500 $/м3 нефти (при очистке препаратом с торфом, 100 — 200 кг торфа с микроорганизмами на м3 нефти) 10000 — 30000 $/га почвы (при очистке препаратом с торфом, 30 — 50 кг торфа с микроорганизмами на 100м2 почвы) Как видно из этих данных, затраты на препараты микроорганизмов с сорбентами выше в 15 — 300 раз. Фирмы, производящие коммерческие биопрепараты-деструкторы нефти без носителя, реализуют препараты по цене 35-45 долл. США за 1 кг сухого биопрепарата. Для сравнения — стоимость 1 кг биопрепарата — кормовой добавки (белково-витаминного концентрата) 1-2 долл. США/кг. По рекомендациям специалистов, принимавших непосредственное участие в разработке биопрепаратов-деструкторов нефти, любой препарат становится эффективным (т.е. способным очистить загрязненный участок нефти в почвенно-климатических условиях средней полосы РФ за 1 сезон) при расходе препарата 1кг на 100 кг нефти. Приведенные в табл.1 и 2 цифры, взятые из рекламных источников фирм и патентов, действительны для небольших степеней загрязнения природных сред нефтепродуктами. Таким образом, фактические затраты на биопрепарат на обработку 1 т разлитой нефти составят 350-450 долл. США/т разлитой нефти или нефтепродукта. При таких затратах следует ожидать, что любые мероприятия, нацеленные на экономию биопрепарата или правильный выбор эффективного и работоспособного биопрепарата-деструктора могут дать существенный экономический эффект как для виновника загрязнения, за чей счет производится очистка загрязненной природной среды (или который выплачивает штрафы за причиненный ущерб), так и для организации, финансирующей проведение комплекса работ по биотехнологической очистке природных сред. Таким образом, порядок затрат на очистку природных сред от нефтяных загрязнений100-1000 долл. США на гектар почвы или тонну разлитой нефти. Загрязнение нефтью земельного участка приводит к понижению его стоимости, а удаление загрязнения возвращает его стоимость до прежнего уровня. В этом случае положительный эколого-экономический эффект может быть получен при колебаниях цены земли в связи с загрязнением 100-1000 долл. США/га или 1-10 долл. США за сотку (без учета стоимости работ на обработку участка и проведение агротехнических мероприятий).

yaneuch.ru

Биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микробиологической очистке почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, в том числе от мазута. Биопрепарат содержит в (мас.%): глицерин - 8-10, KNO3 - 0.360-0.367, Kh3PO4 - 0.054-0.055, Na2HPO4·12h3O - 0.126-0.128, нефтеокисляющие микроорганизмы - не менее 3-1010 кл/мл препарата, вода - остальное. Изобретение обеспечивает высокоэффективную очистку почвы и воды от нефти и нефтепродуктов. 2 ил., 1 табл.

 

Изобретение относится к экологической биотехнологии и может быть использовано при микробиологической очистке почвы и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. Загрязнение нефтепродуктами природных экосистем и сельхозугодий является приоритетной проблемой современной экологической биотехнологии. Это связано с возрастающим объемом несанкционированных выбросов нефтепродуктов при их добыче, транспортировке, переработке и хранении. Проблема усугубляется увеличением потребностей в энергоносителях и углеводородном сырье.

Для ликвидации загрязнений нефтепродуктами успешно применяют биологические методы. Используемые в настоящее время биопрепараты включают различные нефтеокисляющие микроорганизмы - бактерии и реже грибы. В состав препаратов могут входить различные добавки, улучшающие выживаемость и активность нефтеокисляющих микроорганизмов при их хранении и использовании.

Известен биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов «Нафтокс» (патент RU 2053206, МПК B09C 1/10), представляющий собой аэробные нефтеокисляющие бактерии, нормальные парафины, щавелевокислый аммоний и воду.

Недостатком данного биопрепарата является его низкая эффективность при очистке почвы от биологически устойчивых высококипящих нефтепродуктов, например мазута. Использование данного биопрепарата ограничено очисткой от нефти и дизельного топлива.

Известен биопрепарат - консорциум микроорганизмов «Деворойл» для очистки почвенных и солоновато-водных экосистем от загрязнения нефтепродуктами (патент RU 2023686, МПК C02F 3/34).

Недостатком данного биопрепарата является его малая эффективность при ликвидации нефтяных загрязнений почвы из-за преимущественной деградации используемыми микроорганизмами парафиновой фракции нефти.

Известен биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов (патент RU 2138451, МПК В09С 1/10), включающий аэробные нефтеокисляющие бактерии, минеральные добавки и наполнитель, например стерильный торф.

Недостатком данного биопрепарата является нерентабельность его получения в регионах, удаленных от мест расположения залежей торфа, используемого в качестве наполнителя.

Наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому эффекту является биопрепарат для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов (патент RU 2191752, МПК В09С 1/10), включающий аэробные нефтеокисляющие бактерии, воду, полиэтиленгликоль, сахарозу и нефть.

Недостатком прототипа является его низкая эффективность при очистке воды и почвы от биологически устойчивых нефтепродуктов, например мазута.

Задачей настоящего изобретения является разработка биопрепарата, обеспечивающего высокоэффективную очистку почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, в том числе биологически устойчивого мазута.

Поставленная задача решается посредством биопрепарата, включающего клетки аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов, глицерин, минеральные соли и воду при следующем соотношении компонентов:

В качестве аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов биопрепарат содержит штаммы, а именно: Arthrobacter sp. BKM Ас-2272 Д и Rhodococcus sp. BKM Ас-2045 Д, депонированные во Всероссийской коллекции микроорганизмов. Непатогенность штаммов доказана в остром опыте на белых мышах. Данные штаммы являются высокоактивными деструкторами различных нефтепродуктов и индивидуальных углеводородов в широком диапазоне температур и значений рН. Особенностью является способность к окислению нефтепродуктов при высоких температурах - 35-40°С. Штаммы способны к деградации биологически устойчивых высококипящих нефтепродуктов, недоступных для большинства нефтеокисляющих микроорганизмов. Концентрация жизнеспособных аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов в биопрепарате не менее 3·1010 кл/мл достаточна его для эффективного применения.

Эффективность препарата обусловлена входящими в его состав штаммами и добавками, взятыми в указанных процентных содержаниях. Высокий предел температурной устойчивости микроорганизмов штаммов позволяет им сохранить деструкционную активность в условиях повышенных температур, когда возрастает биологическая доступность высококипящих нефтепродуктов. Отсутствие фитотоксичности биопрепарата позволяет применять фиторемедиацию на завершающих стадиях очистки. Известно использование глицерина, взятого в концентрации 10%, для увеличения эффективности низкотемпературного хранения штаммов (Методы общей бактериологии: Пер. с англ/Под ред. Герхарда и др. - М.: МИР, 1983 с.527). Экспериментально было выявлено, что концентрация глицерина может быть и меньшей, а именно 8-10%. Но при этом поставленная задача решается. Входящий в состав биопрепарата глицерин является криопротектором, обеспечивающим высокую выживаемость микроорганизмов при низкотемпературном хранении. Минеральные соли служат для предотвращения осмотического шока микроорганизмов, а также для обеспечения микроорганизмов биогенными элементами на начальных стадиях очистки. Расход биопрепарата - не менее 1.4 л на тонну очищаемой нефтезагрязненной почвы или воды.

На фиг.1 представлено снижение концентрации нефтепродуктов в минеральной среде, загрязненной мазутом и нефтью, при очистке с использованием биопрепарата. На фиг.2 - снижение концентрации нефтепродуктов при очистке загрязненной мазутом почвы.

Пример 1. Получение биопрепарата.

Клетки аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов штаммов Arthrobacter sp. BKM Ас-2272 Д и Rhodococcus sp. BKM Ас-2045 Д выращивали совместно глубинным культивированием на жидкой минеральной среде с дизельным топливом при контроле и соблюдении оптимальных параметров культивирования. Для приготовления жидкой минеральной среды в 10 литрах воды растворяли 40 г KNO3, 6 г Kh3PO4 и 14 г Na2HPO4·12h3O. Дополнительно вносили 200 г дизельного топлива и 8 г MgSO4·7h3O. После глубинного культивирования с использованием аппарата культивирования АК 210 в 10 литров жидкости, содержащей нефтеокисляющие микроорганизмы Arthrobacter sp. BKM Ас-2272 Д и Rhodococcus sp. BKM Ас-2045 Д в концентрации не менее 3·1010 кл/мл, вносили 870 г глицерина для достижения конечной концентрации последнего 8%. Присутствие минеральных солей в жидком биопрепарате в концентрациях: KNO3 - 0.360, Kh3PO4 - 0.054 и Na2HPO4·12h3O - 0.126% обеспечено составом исходной жидкой минеральной среды, в которой происходило культивирование. Биопрепарат готов к использованию для очистки почвы и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, либо замораживается и хранится при температуре не выше 10°С в течение 1 месяца.

Пример 2. Получение биопрепарата.

Клетки аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов штаммов Arthrobacter sp. BKM Ас-2272 Д и Rhodococcus sp. BKM Ас-2045 Д выращивали, как описано в примере 1, на аналогичной жидкой питательной среде, затем к 10 литрам жидкости, содержащей не менее 3·1010 кл/мл, добавили 1110 г глицерина для достижения конечной концентрации последнего 10%. Присутствие минеральных солей в концентрациях:

KNO3 - 0.367%, Kh3PO4 - 0.055% и Na2HPO4·12h3O - 0.128% обеспечено составом исходной минеральной среды, в которой происходило культивирование, с учетом объема внесенного глицерина. Препарат готов к использованию для очистки почвы и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, либо замораживается и хранится при температуре не выше 10°С в течение 1,5 месяца.

Пример 3. В 4 колбы на 0.5 л, содержащие по 200 мл жидкой минеральной среды, представляющей собой воду с растворенными в ней солями KNO3, Kh3PO, Na2HPO4·12h3O, MgSO4·7h3O в концентрациях 4.0, 0.6, 1.4 и 0.8 г/л соответственно, внесли нефть и нефтепродукты. В две колбы - по 4 г российской нефти, а в две другие - по 4 г мазута. В одну колбу с внесенным мазутом и в одну колбу с внесенной нефтью добавили по 0,28 мл биопрепарата, приготовленного согласно примеру 1 и содержащего нефтеокисляющие микроорганизмы штаммов Arthrobacter sp. BKM Ас-2272 Д и Rhodococcus sp. BKM Ас-2045 Д в концентрации не менее 3·1010 кл/мл. В остальные две колбы биопрепарат не добавляли. Все 4 колбы культивировали 7 суток на орбитальном шейкере при температуре 25°С. Снижение концентрации нефтепродуктов в минеральной среде приведено на фиг.1. Степень деструкции нефти при обработке биопрепаратом составила 88.6%, мазута - 76,55%. Таким образом, по очистке загрязнения мазутом в водной среде биопрепарат оказался более эффективен по сравнению с прототипом. При очистке нефтяного загрязнения биопрепарат также обладал более высокой по сравнению с прототипом эффективностью.

Пример 4. В 4 стакана на 600 мл помещали по 300 г почвы, загрязненной российской нефтью либо мазутом до концентрации 46 г/кг. В стаканы вносили по 0,42 мл биопрепарата, приготовленного в примере 2, воду до 60% полной влагоемкости почвы и аммофос в количестве 0,2 г.Инкубировали в течение 4 месяцев при температуре 25° и 40°С. Очищаемую почву регулярно перемешивали, влажность и концентрацию биогенных элементов измеряли и поддерживали на начальном уровне. Степени деструкции нефтепродуктов определяли после 2 и 4 месяцев эксперимента (таблица 1). В стаканах, куда биопрепарат не вносили, деструкция нефтепродуктов через 4 месяца инкубирования не превышала в случае мазута - 6.1%, нефти - 8,4%.

Таблица 1. Деструкция нефтепродуктов в почве после обработки биопрепаратом в зависимости от температуры и продолжительности очистки

нефтепродукт температура, °С деструкция нефтепродуктов, %
2 мес очистки 4 мес очистки
нефть 25 69,8 94,0
40 78,4 90,3
мазут 25 47,2 85,1
40 56,3 89,7

Таким образом, очистка почвы от нефти и нефтепродуктов (мазута) с использованием биопрепарата по своей эффективности выше, чем у прототипа.

Пример 5. На грунтовой площадке было размещено 0,1 тонны почвы, загрязненной мазутом в концентрации 54 г/кг. В почву вносили биопрепарат, приготовленный в примере 1, в количестве 0,14 л. Перемешивали, поддерживали влажность на уровне 60% от предельной влагоемкости, вносили по 20 г аммофоса и нитроаммофоски. Обработки удобрениями, увлажнение, рыхление проводили 3 раза в месяц. Снижение концентрации нефтепродуктов в загрязненной мазутом почве показано на фиг.2. После 5 месяцев очистки концентрация нефтепродуктов составила 8.7 г/кг. Таким образом, эффективность очистки составила 83,8%. Эффективность аналогичной очистки без внесения биопрепарата составила 12%. Таким образом, применение биопрепарата согласно изобретению позволяет проводить эффективную очистку почвы от мазута - биологически устойчивого нефтепродукта.

Пример 6. Участок почвы, загрязненной нефтью в концентрации 31 г/кг на глубину 0,2 м, площадью 2 м2, был обработан 0,84 л биопрепарата, приготовленного в примере 2. Участок культивировали на глубину 0,2 м, внесли 60 г аммофоса и поддерживали влажность на уровне 60% от предельной влагоемкости почвы. Обработки удобрением, увлажнение, рыхление проводили 2 раза в месяц. После 6 месяцев очистки концентрация нефтепродуктов снизилась до 1,4 г/кг. Эффективность очистки составила 95,5%. Эффективность аналогичной очистки без внесения биопрепарата составила 16,1%.

Пример 7. В сосуд объемом 1 л, заполненный 0,5 л воды, вносили нефть в количестве 3,9 мл. На поверхности воды при этом образовывалась пленка нефти толщиной 0,5 мм. На поверхность воды вносили разбрызгиванием 1,5 мл биопрепарата, приготовленного в примере 1. В аналогичный сосуд, вносили 0,5 л воды, 3,9 мл нефти, биопрепарат при этом не добавляли. В оба сосуда внесли по 0,2 г минерального удобрения (аммофос) в качестве дополнительного источника минерального питания. Сосуды культивировали в статических условиях 1 месяц при температуре 28°С, после чего было отмечено разрушение нефтяной пленки в сосуде, куда был внесен биопрепарат. Разрушение нефти в сосуде в результате обработки биопрепаратом составило 89%. В аналогичном сосуде, куда биопрепарат не вносили, разрушение нефти составило 5%.

Пример 8. В сосуд объемом 1 л, заполненный 0,5 л воды, вносили мазут в количестве 3,9 мл. На поверхности воды при этом образовывалась пленка нефтепродукта толщиной 0,5 мм. На поверхность воды вносили разбрызгиванием 1,5 мл биопрепарата, приготовленного в примере 2. В аналогичный сосуд, содержащий воду, загрязненную нефтепродуктом в том же количестве, биопрепарат не добавляли. В оба сосуда внесли по 0,2 г минерального удобрения (аммофос) в качестве дополнительного источника минерального питания. Сосуды культивировали при температуре 28°С в статических условиях 1 месяц. Разрушение мазута в сосуде в результате обработки биопрепаратом составило 79%. В аналогичном сосуде, куда биопрепарат не вносили, разрушение нефти составило 3%.

Преимуществом предлагаемого биопрепарата по сравнению с прототипом является более эффективная очистка воды и почвы от нефти, а также мазута, являющегося устойчивым загрязнителем внешней среды.

Применение биопрепарата согласно изобретению позволяет осуществлять высокоэффективную очистку почвы и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в том числе мазутом. Входящие в состав биопрепарат культуры непатогенны и способны к деструкции нефти и нефтепродуктов в широком диапазоне температур.

Биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, включающий клетки аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов, глицерин, минеральные соли и воду, отличающийся тем, что в качестве аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов используют штаммы Arthrobacter sp. BKM Ас-2272 Д и Rhodococcus sp. BKM Ас-2045 Д при следующем соотношении компонентов, мас.%:

глицерин 8-10
KNO3 0,360-0,367
Kh3PO4 0,054-0,055
Na2HPO4·12h3O 0,126-0,128
нефтеокисляющие микроорганизмы не менее 3·1010
кл/мл препарата
вода остальное

www.findpatent.ru

Биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Биопрепарат содержит, мас.%: нормальные парафины C12-C18 - 1,0-1,5, щавелевокислый аммоний - 0,05-0,1, хлористый калий - 0,1-0,5, водосодержащую культуральную жидкость на основе аэробных нефтеокисляющих бактерий - до 100. В качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий он содержит бактерии Mycobacterium phlei. Увеличение срока годности препарата до 3-х месяцев достигается за счет введения в препарат хлористого калия, который подавляет вредное воздействие продуктов жизнедеятельности бактерий на сами бактерии. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

 

Изобретение относится к жидким (водосодержащим) препаратам для микробиологической очистки почв и поверхностей водоемов от нефти и нефтепродуктов.

Очистка почв и водоемов от загрязнений нефтью и нефтепродуктами является актуальной и сложной задачей защиты окружающей среды. Одним из направлений решения этой задачи является очистка загрязненных почв и поверхности воды с помощью биологических препаратов (биодеструкторов), при обработке которыми происходит разрушение углеводородов нефти за счет интродукции в загрязненную экосистему нефтеокисляющих микроорганизмов.

Известен бактериальный препарат "Путидойл" [ТУ 64-16-75-91. Препарат бактериальный Путидойл], предназначенный для ускорения разложения нефти, в состав которого входит углеводородокисляющий штамм Pseudomonas putida. Его недостатком является сложная технология приготовления, которая предусматривает распылительную сушку живой культуры бактерий. Такой метод сушки не позволяет получить препарат с высоким титром клеток вследствие инактивации клеток под действием высоких температур. (+60°С). Для восстановления жизнедеятельности бактерий перед использованием препарата применяют следующие меры: перемешивают препарат в большом количестве подогретой до 18-28°С воды, и производят аэрирование в течение длительного времени (16-24 ч). Это усложняет, а порой делает неприемлемым применение препарата в полевых условиях. Кроме того, препарат "Путидойл" оказывает угнетающее действие на естественный микробный ценоз [Новиков Ю.В. и Комзолова Н.В. Исследования бактериального препарата Путидойл, предназначенного для очистки водоемов от нефти. Водное хозяйство, 1992, N 2, с.121-123].

Известен водосодержащий биопрепарат "Лессорб-био", защищенный патентом РФ 2193533 [патентом на изобретение РФ 2193533, опубл. 27.11.2002], который содержит аэробные нефтеокисляющие бактерии и органический субстрат - сорбент "Лессорб" (17,5-10,5%), представляющий собой продукт обработки растительного материала (мох, древесина, торф). В качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий биопрепарат содержит штаммы: Mycobacterium flavescens EX-91, Mycobacterium species ИЖ 4, Rhodococcus species 56Д, Acinetobacter species HB-1, подобранные в соответствии с условиями очищаемой территории. Недостатком этого препарата, как и описанного выше, является сложность состава, в том числе бактериального, а также сложность многостадийной технологии приготовления, которая предусматривает раздельное выращивание компонентов микробной массы, приготовление концентрированной клеточной суспензии, перемешивание с сорбентом и последующую сушку компонентов.

В качестве прототипа выбран биопрепарат «Нафтокс» для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, описанный в патенте РФ 2053206 [Патент РФ на изобретение №2053206, опубл. 27.01.1996]. Препарат содержит нормальные парафины (C12-C18) - 1,0-1,5%, щавелевокислый аммоний (ЩКА) - 0,05-0,1%, воду - 98,95-98,40 и аэробные нефтеокисляющие бактерии, входящие наряду с водой в состав культуральной жидкости. В качестве бактерий в препарате использованы Mycobacterium phlei или Pseudomonas aeruginosa или Rhodococcus species. Препарат позволяет достаточно эффективно производить очистку почвы и поверхности воды от нефтяных загрязнений, имеет несложную технологию приготовления, однако, как показали испытания, имеет срок хранения не более 1 мес.

Задача, решаемая изобретением, - увеличение срока хранения (сохранения жизнеспособности бактерий) препарата до 3-х месяцев.

Достигаемый технический результат - подавление вредного воздействия продуктов жизнедеятельности бактерий на сами бактерии.

Задача решается тем, что биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, включает водосодержащую культуральную жидкость на основе аэробных нефтеокисляющих бактерий, нормальные парафины C12-C18, щавелевокислый аммоний и дополнительно содержит хлористый калий, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

нормальные парафины С12-C18 1,0-1,5
щавелевокислый аммоний 0,05-0,1
хлористый калий 0,1-0,5
водосодержащая культуральная
жидкость на основе аэробных
нефтеокисляющих бактерии остальное до 100

В качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий биопрепарат может содержать бактерии Mycobacterium phlei штамм 5КВ (депонированный во ВНИИСХТ под №375 А) в конечной концентрации не ниже 5 109 клеток/мл препарата, или бактерии Pseudomonas aemginosa штамм 4D (коллекция заявителя - ФГУП «ВНИГРИ») в конечной концентрации не ниже 6·109 клеток/мл препарата, или Rhodococcus species штамм 1АХ (коллекция заявителя - «ВНИГРИ») в конечной концентрации не ниже 7·109 клеток/мл препарата. Биопрепарат отличается также тем, что перед применением его разводят водой максимально в соотношении 1:100.

Заявленный биопрепарат готовят следующим образом.

В отличие от прототипа, в котором нормальные парафины ряда C12-C18 и щавеливокислый аммоний вносятся при приготовлении рабочей формы препарата, в настоящем изобретении нормальные парафины ряда C12-C18 и щавеливокислый аммоний (ЩКА) вносят в ферментационную среду, содержащую аэробные нефтеокисляющие бактерии и воду, на их основе получают водосодержащую культуральную жидкость, и уже в нее вносят хлористый калий.

Пример 1

Для приготовления 100 г препарата в водосодержащую кукурозо-мелассовую ферментационную среду, содержащую соли калия, кальция и магния, вместе с посевным материалом - Mycobacterium phlei, штамм 5КВ, в количестве 50×106 клеток/мл, добавляют 0,1 г ЩКА и 1 г нормальных парафинов ряда C12-C18. Через 48 ч при титре Mycobacterium phlei штамм 5КВ 5.1×109 клеток/мл в водосодержащую культуральную жидкость вводят хлористый калий в количестве 0,1 г, что соответствует ~0,1 мас.% хлористого калия, ~0,1 мас.% ЩКА, ~1 мас.% нормальных парафинов ряда C12-C18 в биопрепарате.

Пример 2

Для приготовления 100 г препарата в водосодержащую ферментационную среду, содержащую глицерин, дрожжевой экстракт, соли калия и магния, вместе с посевным материалом в количестве 50×106 клеток/мл Pseudomonas aeruginosa штамм 4D, добавляют 0,1 г ЩКА и 1 г нормальных парафинов ряда C12-C18. Через 48 ч при титре Pseudomonas aeruginosa 4D - 6,5×109 клеток/мл в водосодержащую культуральную жидкость вводят хлористый калий в количестве 0,1 г, что соответствует ~0,1 мас.% хлористого калия, ~0,1 мас.% ЩКА, ~1 мас.% нормальных парафинов ряда C12-C18 в биопрепарате.

Пример 3

Для приготовления 100 г препарата в водосодержащую кукурозо-мелассовую ферментационную среду, содержащую соли калия, кальция и магния, вместе с посевным материалом в количестве 50×106 клеток/мл Rhodococcus species штамм 1АХ добавляют 0,1 г ЩКА и 1 г нормальных парафинов ряда C12-C18. Через 48 ч при титре Rhodococcus species штамм 1АХ - 7.4 ×109 клеток/мл в водосодержащую культуральную жидкость вводят хлористый калий в количестве 0,1 г, что соответствует ~0,1 мас.% хлористого калия, - 0,1 мас.% ЩКА, ~1 мас.% нормальных парафинов ряда C12-C18 в биопрепарате.

Для исследования срока сохранения жизнеспособности бактерий в биопрепарате, были изготовлены пробы с теми же веществами, но в различных весовых соотношениях, в заявляемых пределах. Состав биопрепарататов, наряду с описанными выше примерами, представлен в таблице. Для подтверждения увеличения срока сохранения жизнеспособности бактерий биопрепарата по отношению к прототипу были проведены соответствующие исследования титров бактерий. Результаты исследований представлены в этой же таблице.

Исследования показали, что оптимальная концентрация KCl в препарате для Mycobacterium phlei штамм 5КВ - 0,5%; для Pseudomonas aeniginosa штамм 4D и Rhodococcus species штамм 1АХ - 0,1% и 0,3% соответственно.

Как видно из таблицы, введение в биопрепарат хлористого калия, наряду с ЩКА и парафинами, позволяет сохранить высокий титр бактерий, то есть сохранить жизнеспособность бактерий препарата в течение не менее 3 мес (практически на уровне не менее 50% от исходного). Для сравнения в таблице приведены данные по препарату Нафток, титр которого через 3 мес составил 3% от исходного значения. Как показали исследования заявляемого препарата, сохранение высокого титра в течение долгого времени (срок хранения не менее 3 мес) является следствием того, что хлористый калий подавляет вредное воздействие продуктов жизнедеятельности бактерий на сами бактерии, сохраняя тем самым первоначальный титр.

Заявленный препарат применяется следующим образом.

Перед очисткой нефтезагрязненной почвы готовый препарат разводят водой максимально в соотношении 1:100. Полученный рабочий раствор препарата наносят на поверхность, например, путем опрыскивания или полива. Обработанную почву перепахивают на глубину 20-25 см с последующим 3-4-кратным культивированием в течение летне-осеннего сезона. Расход препарата зависит от степени загрязнения, и от вида нефтепродуктов и типа почвы и составляет 300-400 л на га.

Очистка загрязненных поверхности водоемов осуществляется в теплое время года при температуре воды не ниже 12°С (оптимальная температура в поверхностном слое воды - не ниже 20°С) путем опрыскивания.

Препарат действует более эффективно при спокойной воде и отсутствии сноса препарата.

Научно-производственная практика показала высокую эффективность заявленного биопрепарата. Степень очистки почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, составляет от 50 до 99,4% в зависимости от вида загрязнителя, его состава, содержания в почве и времени очистки. При высокой степени очистки нефтезагрязнение почвы, как показал мониторинг, может быть снижено до значения ПДК.

1. Биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, характеризующийся тем, что содержит водосодержащую культуральную жидкость на основе аэробных нефтеокисляющих бактерий, нормальные парафины C12-C18, щавелево-кислый аммоний и хлористый калий при следующем соотношении компонентов, мас.%:

нормальные парафины C12-C18 1,0-1,5
щавелево-кислый аммоний 0,05-0,1
хлористый калий 0,1-0,5
водосодержащая культуральная жидкость
на основе аэробных нефтеокисляющих бактерий остальное до 100

2. Биопрепарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий он содержит бактерии Mycobacterium phlei штамм 5 KB в конечной концентрации не ниже 5·109 клеток/мл препарата.

www.findpatent.ru

Биопрепарат для очистки морской воды от нефти

Изобретение относится к средствам борьбы с нефтяным загрязнением и может быть использовано при ликвидации последствий аварийных нефтяных разливов в море. Биопрепарат на основе углеводородокисляющего штамма Phyllobacterium myrsinacearum ВКПМ В-9079 получен путем последовательного культивирования штамма на среде с пептоном, сахарозой, источником фосфора, калия, магния, и на среде с кукурузным экстрактом, сахарозой, источником фосфора, калия, магния. С последующим разведением полученного концентрата стерильной дистиллированной водой, в которую добавляют (г/л): концентрат бактериальной суспензии - 100,0; меласса - 20,0; K2HPO4 - 1,5; Kh3PO4 - 1,5; MgSO4 - 1,5, или смешивание полученного концентрата с 15% раствором мелассы и водой в соотношении 1:1:1, инокулирование полученной смесью стерильного вермикулита, вспученного с последующим поверхностным культивированием в течение 3-5 дней при 18-20°С. Биопрепарат эффективно и в короткий срок утилизирует нефтяные углеводороды, в том числе полиядерные ароматические. Убыль суммарных нефтяных углеводородов через 15 суток очистки жидким биопрепаратом составила 84,1%, сухим биопрепаратом - 78,1%. Применение жидкой формы биопрепарата снизило суммарное содержание ПАУ на 75,2%, сухой формы - на 76,9%. 4 табл.

 

Изобретение относится к средствам борьбы с нефтяным загрязнением и может быть использовано для очистки морской воды от нефти. Биопрепарат представлен в жидкой и сухой формах, создан на основе углеводородокисляющего штамма Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 с титром клеток 109 / мл/г. В состав жидкого препарата входят биомасса штамма и жидкая питательная среда, содержащая источники азота, калия, фосфора и магния. Сухая форма биопрепарата содержит штамм, иммобилизованный в поры носителя, в качестве которого используют стерильный адсорбент вермикулитовый вспученный. Биопрепарат эффективно и в короткий срок утилизирует нефтяные углеводороды, в том числе полиядерные ароматические.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предлагаемое изобретение относится к средствам борьбы с нефтяным загрязнением и может быть использовано для очистки морской воды от нефти.

Известны разнообразные биопрепараты на основе нефтеокисляющих микроорганизмов и их ассоциаций, предназначенные для очистки окружающей среды от нефти и нефтепродуктов (а.с. СССР №1076446, 1982; патенты РФ 2023686, 1994; 2122980, 1998; 2174496, 2001; 2191753, 2002; 2191752, 2002).

Наиболее близким к предлагаемому биопрепарату является биопрепарат «Авалон» (патент РФ №2181701, кл. C02F 3/34, С12Р 39/00, В09С 1/20, C12N 1/20, 2002), который содержит пористый носитель в виде вспененных стеклообразных метафосфатов переменного состава и штаммы микроорганизмов-деструкторов нефти (Serratia marcescens PL-1, Pseudomonas fluorescens biovar II 10-1, Acidovorax delafieldii 3-1), взятый нами за прототип.

Его недостатком является то, что предлагаемые микроорганизмы могут быть патогенными и применение биопрепарата может представлять опасность в медицинском и санитарно-гигиеническом отношении. Кроме того прототип предлагает к использованию коллекционные штаммы, а с точки зрения экологической безопасности и эффективности в состав биопрепаратов должны входить аборигенные микроорганизмы, свойственные конкретному очищаемому от нефти объекту.

Задачей изобретения является разработка такого биопрепарата для очистки морской воды от нефти, который позволил бы обеспечить экологическую, медицинскую и санитарно-гигиеническую безопасность его применения.

Это достигается за счет того, что в качестве биодеструктора используют углеводородокисляющий бактериальный штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1, выделенный из вод Северного Каспия, отобранных в районе разведочного бурения нефтяных скважин. Филогенетическое положение штамма проведено на основании секвенирования гена 16S рРНК 6 Центре "Биоинженерия" РАН и ИНМИ РАН.

Данный штамм защищен патентом (2268934) и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (коллекционный номер ВКПМ В-9079).

Штамм не токсичен, не обладает вирулентными и токсигенными свойствами, не диссеминирует во внутренних органах лабораторных животных.

Анализ литературных данных и известных технических решений показывает, что не имеется сведений о биопрепаратах для очистки объектов окружающей среды от нефтяного загрязнения с использованием бактерий рода Phyllobacterium. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условиям патентоспособности "новизна", "изобретательский уровень".

В качестве деструктора нефти используют бактериальный штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1. Хранение штамма осуществляют на агаризованной питательной среде (МПА) с Периодическими пересевами (3-4 раза в год). Инкубирование после пересева ведут при температуре 28°С в течение 3-4 дней, затем культуру хранят в холодильнике при температуре 4°С, а также в лиофилизированном состоянии в ампулах.

Штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками: Грамвариабельные прямые подвижные палочки, спор не образуют. Образуют на МПА круглые, выпуклые, блестящие, слизистые, 1-2 мм в диаметре колонии с ровными краями от светло-розового до красного цвета. Оксидазоположительный, каталазоположительный, галотолерантный (рост в интервале солености 0,05-20% NaCl), не гидролизует крахмал, казеин, пектин и целлюлозу, не разжижает желатин, не образует сероводород и индол, восстанавливает нитраты в нитриты, образует кислоту из глюкозы, не окисляет лактозу. Не имеет аргининдегидролазы, лизин- и орнитиндекарбоксилаз, уреазы, фенилаланиндезаминазы, β-галактозидазы, не утилизирует цитрат и малонат натрия, цитрат натрия с глюкозой. Способен к росту на средах Чапека, Миллса, Кинга, магниево-калиево-дрожжевой (МКД), Маккланга, на средах, приготовленных на основе отрубей, мелассы, кукурузного, мясного или дрожжевого экстрактов, картофельного или горохового отваров как с добавлением дизельного топлива и нефти, так и без добавления.

Бактериальный штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1, выращиваемый на стандартных средах и средах с добавлением морской соли, способен размножаться и деградировать до 96% углеводородов за 30 суток в диапазоне солености 0,05-20,0%.

В первом примере биопрепарат представлен в жидкой форме, в состав которого входят биомасса углеводородокисляющего штамма Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 и жидкая питательная среда.

Для получения посевного материала указанного штамма используют жидкую питательную среду следующего состава, г/л воды: пептон - 10,0; сахароза - 10,0; Kh3PO4 - 0,5; K2HPO4 - 0,5; MgSO4×7h3O - 0,3.

Приготовленную жидкую среду разливают в качалочные колбы по 100 мл, при этом объем качалочной колбы - 750 мл. Среду засевают смывом с одного косяка и колбу помещают на качалку при 220 об/мин с температурой 28-30°С на 72 часа. Получают титр 0,5-1,0 млрд/мл. Для достижения титра около 1-2×109 КОЕ/мл время культивирования - 96 часов.

Посевной материал можно хранить в холодильнике до 1 месяца при температуре плюс 4-6°С.

Посевной материал вносят в ферментер и проводят глубинное культивирование в аэробных условиях при температуре 28-30°С с постоянно работающей мешалкой при коэффициенте заполнения 0,8 на среде следующего состава (г/л воды): кукурузный экстракт - 10,0; сахароза - 10,0; Kh3PO4 - 0,5; K2HPO4 - 0,5; MgSO4×7h3O - 0,3; рН=7,5.

Полученный в ферментерах концентрат суспензии штамма разводят стерильной дистиллированной водой, в которую добавляют (г/л): концентрат бактериальной суспензии - 100,0; меласса - 20,0; K2HPO4 - 1,5; Kh3PO4 - 1,5; MgSO4 - 1,5; pH=7,5.

Сухая форма биопрепарата включает стерильный субстрат - носитель адсорбент вермикулитовый вспученный, в поры которого искусственно иммобилизован штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1. Для этого субстрат-носитель в пакетах инокулируют смесью концентрата суспензии штамма, 15% стерильного раствора мелассы и воды, взятых в соотношении 1:1:1. Исходный титр инокулированного субстрата-носителя составляет 20×106 КОЕ/г. Осуществляют дополнительное поверхностное культивирование штамма на субстрате-носителе в течение 3-5 дней при 18-20°С.

Для испытания эффективности очистки от нефтяного загрязнения при помощи различных форм биопрепарата были созданы модельные экосистемы с имитацией аварийного разлива нефти в море. Для этого были использованы 20-литровые сосуды, содержащие 15 литров морской воды, отобранной на лицензионном участке ООО «Лукойл-Нижневолжскнефть» Северного Каспия, в которые вносили 1% (по объему) сырой каспийской нефти. В результате была создана модель нефтяного разлива на поверхности морской воды.

Пример 1. Очистка жидкой формой биопрепарата

На поверхность нефтяного разлива в созданных модельных экосистемах с морской водой распыляли жидкий биопрепарат на основе штамма Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 в количестве 20 мл/л (титр клеток 109 /мл).

Контроль моделировал процесс естественного самоочищения за счет физико-химических процессов и деятельности аборигенной микрофлоры воды. Для этого в модельные системы с морской водой и нефтью биопрепарат не вносили.

Экспериментальные системы выдерживали при естественном освещении и свободном газообмене с постоянным перемешиванием в течение 15 суток.

Для испытания деструкционных способностей биопрепарата определяли содержание суммарных нефтяных углеводородов в воде флуориметрическим методом, а также уровень полиядерных ароматических углеводородов.

Начальное содержание нефтяных углеводородов во всех вариантах опыта составило 9,36 г/л.

Через 15 суток очистки жидким биопрепаратом убыль суммарных нефтяных углеводородов составила 84,1%, что на 49,4% превышает аналогичный показатель в сравнении с контролем, где разрушение нефтяных углеводородов происходит в результате физико-химических процессов и деятельности аборигенной микрофлоры морской воды. Результаты эксперимента представлены в таблице 1.

Таблица 1
Убыль углеводородов в ходе испытаний биопрепарата, %
Варианты модельных систем Продолжительность эксперимента, сутки
3 7 15
Контроль 23,6 27,1 34,7
С внесением жидкого биопрепарата 49,5 51,7 84,1

К числу наиболее токсичных и канцерогенных компонентов нефти относятся полиядерные ароматические углеводороды (ПАУ), уровень суммарного содержания которых в начале эксперимента составил 260,2 мкг/л.

Применение жидкой формы биопрепарата снизило суммарное содержание ПАУ на 75,2%, что на 33,7% эффективнее по сравнению с контролем. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2
Убыль полиядерных ароматических углеводородов (ПАУ) через 15 сут эксперимента, %
показатели контроль с внесением жидкого биопрепарата
Нафталин 63,3 97,6
2-метилнафталин 59,6 97,5
Бифенил 17,1 68,5
Аценафтилен 28,9 54,0
Аценафтен 11,8 71,0
Флуорен 13,3 55,6
Фенантрен 26,0 37,3
Антрацен 22,4 47,2
Флуорантен 26,9 60,0
Пирен 27,8 57,5
Хризен 19,1 52,4
Бенз(а)антрацен 20,3 53,6
Бенз(а)пирен 7,3 56,0
Дибенз(а,h)антрацен 42,0 64,5
Сумма 41,5 75,2

В ходе испытаний биопрепарата были отмечены такие эффекты его действия, как исчезновение радужной пленки, присутствующей в начале эксперимента, образование хлопьевидных скоплений деструктированной нефти, более половины площади воды, свободной от загрязнения. В контрольных вариантах без внесения биопрепарата подобных эффектов не наблюдалось.

Пример 2. Очистка сухой формой биопрепарата

На поверхность нефтяного разлива в созданных модельных экосистемах с морской водой распыляли стерильный адсорбент вермикулитовый вспученный в количестве 1 г/л для моделирования физико-химической адсорбции нефти. На поверхность других экспериментальных сосудов с нефтяной пленкой наносили сухой биопрепарат на основе штамма Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 на субстрате-носителе (адсорбенте вермикулитовом вспученном) в количестве 1 г/л (титр клеток 109/г).

Контроль моделировал процесс естественного самоочищения за счет физико-химических процессов и деятельности аборигенной микрофлоры воды. Для этого в модельные системы с морской водой и нефтью биопрепарат не вносили.

Экспериментальные системы выдерживали при естественном освещении и свободном газообмене с постоянным перемешиванием в течение 15 суток.

Для испытания деструкционных способностей биопрепарата определяли содержание в воде суммарных нефтяных углеводородов флуориметрическим методом, а также уровень полиядерных ароматических углеводородов.

Начальное содержание нефтяных углеводородов во всех вариантах опыта составило 9,36 г/л.

При внесении сухого биопрепарата на поверхность воды он некоторое время не тонет, адсорбирует на себе нефтяную пленку, но не насыщается при этом водой. Через сутки часть препарата оседает на дно и функционирует как деструктор нефтяного загрязнения, эмульгированного в водной толще.

Через 3 суток после нанесения биопрепарата на водную поверхность, загрязненную нефтью, вокруг частиц биопрепарата образовалась бактериальная пленка, что свидетельствует о том, что он является для микроорганизмов источником питания. Через 15 суток на поверхности воды полностью отсутствовала радужная пленка.

Испытания показали, что использование адсорбента лишь на 1,2% ускорило процесс естественного самоочищения морской воды от нефтяных углеводородов. Применение сухого биопрепарата на основе штамма Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 на субстрате-носителе было более эффективно, и убыль нефтяных углеводородов в течение 15 суток составила 78,1%, что на 43,4% превышала аналогичный показатель в контроле, где деструкция происходит в результате физико-химических процессов и деятельности аборигенной микрофлоры морской воды. Использование сухого биопрепарата на 42,2% эффективнее, чем очистка адсорбентом. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3
Убыль углеводородов в ходе испытаний биопрепарата, %
Варианты модельных систем Продолжительность эксперимента, сутки
3 7 15
Контроль 23,6 27,1 34,7
С внесением адсорбента 23,4 32,2 35,9
С внесением сухого биопрепарата 45,4 47,4 78,1

Уровень суммарного содержания полиядерных ароматических углеводородов (ПАУ) в начале эксперимента составлял 260,2 мкг/л.

Использование адсорбента снизило их содержание через 15 суток на 62,8%, что на 21,3% больше, чем в контроле за счет процесса естественного самоочищения морской воды. Эффективность очистки от ПАУ через 15 суток с применением сухой формы биопрепарата на основе штамма Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 на субстрате-носителе составила 76,9%, что на 35,4% и 14,1% результативнее по сравнению с контролем и применением адсорбента соответственно. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4
Убыль полиядерных ароматических углеводородов (ПАУ) через 15 сут эксперимента, %
Показатели Контроль С внесением адсорбента С внесением сухого биопрепарата
Нафталин 63,3 69,7 98,3
2-метилнафталин 59,6 91,3 98,1
Бифенил 17,1 58,5 74,0
Аценафтилен 28,9 46,1 59,4
Аценафтен 11,8 26,2 40,8
Флуорен 13,3 52,6 55,1
Фенантрен 26,0 27,6 49,1
Антрацен 22,4 38,4 42,3
Флуорантен 26,9 52,0 59,4
Пирен 27,8 55,9 71,8
Хризен 19,1 50,8 69,0
Бенз(а)антрацен 20,3 53,2 75,2
Бенз(а)пирен 7,3 15,7 35,6
Дибенз(а,h)антрацен 42,0 48,2 58,9
Сумма 41,5 62,8 76,9

Через 15 суток применения биопрепарата отмечено исчезновение радужной пленки, присутствующей в начале эксперимента, образование хлопьевидных скоплений деструктированной нефти, более половины площади воды, свободной от загрязнения. В контрольных вариантах без внесения биопрепарата, а также лишь адсорбента подобных эффектов не наблюдалось.

Таким образом, проведенные испытания предлагаемого биопрепарата показали, что он эффективно и в короткий срок утилизирует нефтяные углеводороды, в том числе полиядерные ароматические, которые более токсичны для живой природы. Бактериальный штамм Phyllobacterium myrsinacearum, входящий в состав биопрепарата, экологически безопасен, не обладает патогенными свойствами для теплокровных животных и удовлетворяет требованиям, предъявляемым к промышленным микроорганизмам. На основании этого его можно рекомендовать для очистки морской воды от нефти.

Источники информации

1. Авторское свидетельство СССР №1076446, кл. C02F 3/34, 1982.

2. Патент РФ №2023685, кл. C02F 3/34, Е02В 15/04, С12Р 39/00, 1994.

3. Патент РФ №2122980, кл. C02F 3/34, В09С 1/10, С12Р 39/00, 1998.

4. Патент РФ №2174496, кл. C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/26, C12R1:01, 2001.

5. Патент РФ №2191753, кл. C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/26, C12R1:01, C12R1:32, 2002.

6. Патент РФ №2191752, кл. C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/26, C12R1:01, C12R1:32, 2002.

7. Патент РФ №2181701, кл. C02F 3/34, С12Р 39/00, В09С 1/20, C12N 1/20, 2002.

Биопрепарат для очистки морской воды от нефти, полученный путем последовательного культивирования штамма Phyllobacterium myrsinacearum ВКПМ В-9079 на среде с пептоном, сахарозой, источником фосфора, калия, магния и на среде с кукурузным экстрактом, сахарозой, источником фосфора, калия, магния и разведение полученного концентрата стерильной дистиллированной водой, в которую добавляют (г/л): концентрат бактериальной суспензии - 100,0; мелассу - 20,0; K2HPO4 - 1,5; Kh3PO4 - 1,5; MgSO4 - 1,5, или смешивание полученного концентрата с 15%-ным раствором мелассы и водой в соотношении 1:1:1, инокулирование полученной смесью стерильного вермикулита вспученного с последующим поверхностным культивированием в течение 3-5 дней при 18-20°С.

www.findpatent.ru

биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов - патент РФ 2365438

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микробиологической очистке почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, в том числе от мазута. Биопрепарат содержит в (мас.%): глицерин - 8-10, KNO3 - 0.360-0.367, Kh3PO4 - 0.054-0.055, Na2HPO4·12h3 O - 0.126-0.128, нефтеокисляющие микроорганизмы - не менее 3-10 10 кл/мл препарата, вода - остальное. Изобретение обеспечивает высокоэффективную очистку почвы и воды от нефти и нефтепродуктов. 2 ил., 1 табл.

Изобретение относится к экологической биотехнологии и может быть использовано при микробиологической очистке почвы и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. Загрязнение нефтепродуктами природных экосистем и сельхозугодий является приоритетной проблемой современной экологической биотехнологии. Это связано с возрастающим объемом несанкционированных выбросов нефтепродуктов при их добыче, транспортировке, переработке и хранении. Проблема усугубляется увеличением потребностей в энергоносителях и углеводородном сырье.

Для ликвидации загрязнений нефтепродуктами успешно применяют биологические методы. Используемые в настоящее время биопрепараты включают различные нефтеокисляющие микроорганизмы - бактерии и реже грибы. В состав препаратов могут входить различные добавки, улучшающие выживаемость и активность нефтеокисляющих микроорганизмов при их хранении и использовании.

Известен биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов «Нафтокс» (патент RU 2053206, МПК B09C 1/10), представляющий собой аэробные нефтеокисляющие бактерии, нормальные парафины, щавелевокислый аммоний и воду.

Недостатком данного биопрепарата является его низкая эффективность при очистке почвы от биологически устойчивых высококипящих нефтепродуктов, например мазута. Использование данного биопрепарата ограничено очисткой от нефти и дизельного топлива.

Известен биопрепарат - консорциум микроорганизмов «Деворойл» для очистки почвенных и солоновато-водных экосистем от загрязнения нефтепродуктами (патент RU 2023686, МПК C02F 3/34).

Недостатком данного биопрепарата является его малая эффективность при ликвидации нефтяных загрязнений почвы из-за преимущественной деградации используемыми микроорганизмами парафиновой фракции нефти.

Известен биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов (патент RU 2138451, МПК В09С 1/10), включающий аэробные нефтеокисляющие бактерии, минеральные добавки и наполнитель, например стерильный торф.

Недостатком данного биопрепарата является нерентабельность его получения в регионах, удаленных от мест расположения залежей торфа, используемого в качестве наполнителя.

Наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому эффекту является биопрепарат для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов (патент RU 2191752, МПК В09С 1/10), включающий аэробные нефтеокисляющие бактерии, воду, полиэтиленгликоль, сахарозу и нефть.

Недостатком прототипа является его низкая эффективность при очистке воды и почвы от биологически устойчивых нефтепродуктов, например мазута.

Задачей настоящего изобретения является разработка биопрепарата, обеспечивающего высокоэффективную очистку почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, в том числе биологически устойчивого мазута.

Поставленная задача решается посредством биопрепарата, включающего клетки аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов, глицерин, минеральные соли и воду при следующем соотношении компонентов:

В качестве аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов биопрепарат содержит штаммы, а именно: Arthrobacter sp. BKM Ас-2272 Д и Rhodococcus sp. BKM Ас-2045 Д, депонированные во Всероссийской коллекции микроорганизмов. Непатогенность штаммов доказана в остром опыте на белых мышах. Данные штаммы являются высокоактивными деструкторами различных нефтепродуктов и индивидуальных углеводородов в широком диапазоне температур и значений рН. Особенностью является способность к окислению нефтепродуктов при высоких температурах - 35-40°С. Штаммы способны к деградации биологически устойчивых высококипящих нефтепродуктов, недоступных для большинства нефтеокисляющих микроорганизмов. Концентрация жизнеспособных аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов в биопрепарате не менее 3·1010 кл/мл достаточна его для эффективного применения.

Эффективность препарата обусловлена входящими в его состав штаммами и добавками, взятыми в указанных процентных содержаниях. Высокий предел температурной устойчивости микроорганизмов штаммов позволяет им сохранить деструкционную активность в условиях повышенных температур, когда возрастает биологическая доступность высококипящих нефтепродуктов. Отсутствие фитотоксичности биопрепарата позволяет применять фиторемедиацию на завершающих стадиях очистки. Известно использование глицерина, взятого в концентрации 10%, для увеличения эффективности низкотемпературного хранения штаммов (Методы общей бактериологии: Пер. с англ/Под ред. Герхарда и др. - М.: МИР, 1983 с.527). Экспериментально было выявлено, что концентрация глицерина может быть и меньшей, а именно 8-10%. Но при этом поставленная задача решается. Входящий в состав биопрепарата глицерин является криопротектором, обеспечивающим высокую выживаемость микроорганизмов при низкотемпературном хранении. Минеральные соли служат для предотвращения осмотического шока микроорганизмов, а также для обеспечения микроорганизмов биогенными элементами на начальных стадиях очистки. Расход биопрепарата - не менее 1.4 л на тонну очищаемой нефтезагрязненной почвы или воды.

На фиг.1 представлено снижение концентрации нефтепродуктов в минеральной среде, загрязненной мазутом и нефтью, при очистке с использованием биопрепарата. На фиг.2 - снижение концентрации нефтепродуктов при очистке загрязненной мазутом почвы.

Пример 1. Получение биопрепарата.

Клетки аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов штаммов Arthrobacter sp. BKM Ас-2272 Д и Rhodococcus sp. BKM Ас-2045 Д выращивали совместно глубинным культивированием на жидкой минеральной среде с дизельным топливом при контроле и соблюдении оптимальных параметров культивирования. Для приготовления жидкой минеральной среды в 10 литрах воды растворяли 40 г KNO 3, 6 г Kh3PO4 и 14 г Na2 HPO4·12h3O. Дополнительно вносили 200 г дизельного топлива и 8 г MgSO4·7h3 O. После глубинного культивирования с использованием аппарата культивирования АК 210 в 10 литров жидкости, содержащей нефтеокисляющие микроорганизмы Arthrobacter sp. BKM Ас-2272 Д и Rhodococcus sp. BKM Ас-2045 Д в концентрации не менее 3·1010 кл/мл, вносили 870 г глицерина для достижения конечной концентрации последнего 8%. Присутствие минеральных солей в жидком биопрепарате в концентрациях: KNO3 - 0.360, Kh3PO 4 - 0.054 и Na2HPO4·12H 2O - 0.126% обеспечено составом исходной жидкой минеральной среды, в которой происходило культивирование. Биопрепарат готов к использованию для очистки почвы и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, либо замораживается и хранится при температуре не выше 10°С в течение 1 месяца.

Пример 2. Получение биопрепарата.

Клетки аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов штаммов Arthrobacter sp. BKM Ас-2272 Д и Rhodococcus sp. BKM Ас-2045 Д выращивали, как описано в примере 1, на аналогичной жидкой питательной среде, затем к 10 литрам жидкости, содержащей не менее 3·1010 кл/мл, добавили 1110 г глицерина для достижения конечной концентрации последнего 10%. Присутствие минеральных солей в концентрациях:

KNO3 - 0.367%, Kh3PO4 - 0.055% и Na2 HPO4·12h3O - 0.128% обеспечено составом исходной минеральной среды, в которой происходило культивирование, с учетом объема внесенного глицерина. Препарат готов к использованию для очистки почвы и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, либо замораживается и хранится при температуре не выше 10°С в течение 1,5 месяца.

Пример 3. В 4 колбы на 0.5 л, содержащие по 200 мл жидкой минеральной среды, представляющей собой воду с растворенными в ней солями KNO3, KH 2PO, Na2HPO4·12h3 O, MgSO4·7h3O в концентрациях 4.0, 0.6, 1.4 и 0.8 г/л соответственно, внесли нефть и нефтепродукты. В две колбы - по 4 г российской нефти, а в две другие - по 4 г мазута. В одну колбу с внесенным мазутом и в одну колбу с внесенной нефтью добавили по 0,28 мл биопрепарата, приготовленного согласно примеру 1 и содержащего нефтеокисляющие микроорганизмы штаммов Arthrobacter sp. BKM Ас-2272 Д и Rhodococcus sp. BKM Ас-2045 Д в концентрации не менее 3·1010 кл/мл. В остальные две колбы биопрепарат не добавляли. Все 4 колбы культивировали 7 суток на орбитальном шейкере при температуре 25°С. Снижение концентрации нефтепродуктов в минеральной среде приведено на фиг.1. Степень деструкции нефти при обработке биопрепаратом составила 88.6%, мазута - 76,55%. Таким образом, по очистке загрязнения мазутом в водной среде биопрепарат оказался более эффективен по сравнению с прототипом. При очистке нефтяного загрязнения биопрепарат также обладал более высокой по сравнению с прототипом эффективностью.

Пример 4. В 4 стакана на 600 мл помещали по 300 г почвы, загрязненной российской нефтью либо мазутом до концентрации 46 г/кг. В стаканы вносили по 0,42 мл биопрепарата, приготовленного в примере 2, воду до 60% полной влагоемкости почвы и аммофос в количестве 0,2 г.Инкубировали в течение 4 месяцев при температуре 25° и 40°С. Очищаемую почву регулярно перемешивали, влажность и концентрацию биогенных элементов измеряли и поддерживали на начальном уровне. Степени деструкции нефтепродуктов определяли после 2 и 4 месяцев эксперимента (таблица 1). В стаканах, куда биопрепарат не вносили, деструкция нефтепродуктов через 4 месяца инкубирования не превышала в случае мазута - 6.1%, нефти - 8,4%.

Таблица 1. Деструкция нефтепродуктов в почве после обработки биопрепаратом в зависимости от температуры и продолжительности очистки

нефтепродукт температура, °С деструкция нефтепродуктов, %
2 мес очистки4 мес очистки
нефть25 69,894,0
40 78,490,3
мазут 25 47,285,1
40 56,389,7

Таким образом, очистка почвы от нефти и нефтепродуктов (мазута) с использованием биопрепарата по своей эффективности выше, чем у прототипа.

Пример 5. На грунтовой площадке было размещено 0,1 тонны почвы, загрязненной мазутом в концентрации 54 г/кг. В почву вносили биопрепарат, приготовленный в примере 1, в количестве 0,14 л. Перемешивали, поддерживали влажность на уровне 60% от предельной влагоемкости, вносили по 20 г аммофоса и нитроаммофоски. Обработки удобрениями, увлажнение, рыхление проводили 3 раза в месяц. Снижение концентрации нефтепродуктов в загрязненной мазутом почве показано на фиг.2. После 5 месяцев очистки концентрация нефтепродуктов составила 8.7 г/кг. Таким образом, эффективность очистки составила 83,8%. Эффективность аналогичной очистки без внесения биопрепарата составила 12%. Таким образом, применение биопрепарата согласно изобретению позволяет проводить эффективную очистку почвы от мазута - биологически устойчивого нефтепродукта.

Пример 6. Участок почвы, загрязненной нефтью в концентрации 31 г/кг на глубину 0,2 м, площадью 2 м2, был обработан 0,84 л биопрепарата, приготовленного в примере 2. Участок культивировали на глубину 0,2 м, внесли 60 г аммофоса и поддерживали влажность на уровне 60% от предельной влагоемкости почвы. Обработки удобрением, увлажнение, рыхление проводили 2 раза в месяц. После 6 месяцев очистки концентрация нефтепродуктов снизилась до 1,4 г/кг. Эффективность очистки составила 95,5%. Эффективность аналогичной очистки без внесения биопрепарата составила 16,1%.

Пример 7. В сосуд объемом 1 л, заполненный 0,5 л воды, вносили нефть в количестве 3,9 мл. На поверхности воды при этом образовывалась пленка нефти толщиной 0,5 мм. На поверхность воды вносили разбрызгиванием 1,5 мл биопрепарата, приготовленного в примере 1. В аналогичный сосуд, вносили 0,5 л воды, 3,9 мл нефти, биопрепарат при этом не добавляли. В оба сосуда внесли по 0,2 г минерального удобрения (аммофос) в качестве дополнительного источника минерального питания. Сосуды культивировали в статических условиях 1 месяц при температуре 28°С, после чего было отмечено разрушение нефтяной пленки в сосуде, куда был внесен биопрепарат. Разрушение нефти в сосуде в результате обработки биопрепаратом составило 89%. В аналогичном сосуде, куда биопрепарат не вносили, разрушение нефти составило 5%.

Пример 8. В сосуд объемом 1 л, заполненный 0,5 л воды, вносили мазут в количестве 3,9 мл. На поверхности воды при этом образовывалась пленка нефтепродукта толщиной 0,5 мм. На поверхность воды вносили разбрызгиванием 1,5 мл биопрепарата, приготовленного в примере 2. В аналогичный сосуд, содержащий воду, загрязненную нефтепродуктом в том же количестве, биопрепарат не добавляли. В оба сосуда внесли по 0,2 г минерального удобрения (аммофос) в качестве дополнительного источника минерального питания. Сосуды культивировали при температуре 28°С в статических условиях 1 месяц. Разрушение мазута в сосуде в результате обработки биопрепаратом составило 79%. В аналогичном сосуде, куда биопрепарат не вносили, разрушение нефти составило 3%.

Преимуществом предлагаемого биопрепарата по сравнению с прототипом является более эффективная очистка воды и почвы от нефти, а также мазута, являющегося устойчивым загрязнителем внешней среды.

Применение биопрепарата согласно изобретению позволяет осуществлять высокоэффективную очистку почвы и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в том числе мазутом. Входящие в состав биопрепарат культуры непатогенны и способны к деструкции нефти и нефтепродуктов в широком диапазоне температур.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, включающий клетки аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов, глицерин, минеральные соли и воду, отличающийся тем, что в качестве аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов используют штаммы Arthrobacter sp. BKM Ас-2272 Д и Rhodococcus sp. BKM Ас-2045 Д при следующем соотношении компонентов, мас.%:

глицерин8-10
KNO30,360-0,367
Kh3 PO40,054-0,055
Na2 HPO4·12h3O 0,126-0,128
нефтеокисляющие микроорганизмы не менее 3·1010
кл/мл препарата
водаостальное

www.freepatent.ru

Биопрепарат для очистки окружающей среды от нефти и нефтепродуктов

Биопрепарат включает консорциум аэробных бактериальных культур, Acidovorax delafieldii ВКПМ В-8358 (НТ-1), Burkholderia caryophylli ВКПМ В-8359 (НТ-4), Pseudomonas fluorescens biovar ВКПМ В-8360 (II НТ-6), Citobacter amalonaticus ВКПМ В-8361 (Ян-3-2), Pseudomonas fluorescens ВКПМ В-8362 (Ян-8-2), Serratia marcescens ВКПМ В-8363 (Ян-10-2) с титром живых клеток не менее 1010. Биопрепарат обладает высокой деструктивной способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов. 1 табл.

 

Изобретение относится к средствам борьбы с загрязнениями объектов окружающей среды нефтью и нефтепродуктами и может быть использовано, например, при ликвидации нефтяных загрязнений.

Поскольку на территории России эксплуатируется более 200 тыс. км магистральных нефтепроводов и 350 тыс. км промысловых нефтепроводов, ежегодно на внутрипромысловых нефтепроводах происходит до 40 тыс. аварий. По мнению специалистов "Гринпис", аварийные потери нефти в России достигают 25 млн. т ежегодно. В нефтезагрязненных почвах подавлена жизнедеятельность биоты, нарушены трофические связи, физико-химические и биологические свойства.

Разлившаяся нефть адсорбируется почвой и в основной массе локализуется в ее верхнем слое. Легколетучие фракции нефти удаляются с поверхности за счет испарения, а тяжелые нефти, смолы и асфальтены практически не выветриваются и медленно просачиваются в глубь почвы. В связи с этим стоит задача разработки высокоэффективных технологий очистки и восстановления окружающей среды, загрязненной нефтью и нефтепродуктами.

Современные нефтеокисляющие препараты представляют собой, как правило, лиофильно высушенную биомассу активных штаммов микроорганизмов, главным образом, бактерий в смеси с азотно-фосфорными соединениями. Иногда в препарат включают нейтральный сорбент.

Часто в качестве нефтеокисляющего препарата используют бактерии рода Pseudomonas (Muracami A., Suzuki К., - J. Oceanogr. Soc. Jap., 1985, v.41, №5, p.p.337-344; Балашова Н.В., Кошелева И.А., Филонов А.Е. и др. Штамм Pseudomonas putida BS 3701 - деструктор фенантрена и нафталина. - Микробиология, 1997, т.66, №4, стр.488-493). Используется также смешанная культура микроорганизмов, например, Flavobacterium и Pseudomonas (Horowitz A., Atlas R.M. - Biodeterior. Ргос. 4th Int. Bioterior. Symp., Berlin, Londjn, - 1980, p.15-30). Анализ литературных источников свидетельствует о целесообразности использования групп микроорганизмов для утилизации нефти и нефтепродуктов. Американская фирма "Polybac Corporation" выпускает препараты "Фенобак" и "Петробак" (Stoff С.В. - Chemical proceeding, 1982, №12 (Dec.), p.11). Препараты содержат мутантные штаммы бактерий. Известен также препарат "Гидробак" (там же).

Наиболее близким аналогом к заявляемому биопрепарату является биопрепарат фирмы "Полиинформ" (патент РФ №2138451, С02F 3/34, 1997 г.). Биопрепарат включает аэробные нефтеокисляющие бактерии, минеральные добавки и наполнитель. В качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий содержится консорциум мезофильных бактериальных штаммов Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus species ПИ Ку-1 и консорциум психрофильных бактериальных штаммов Pseudomonas fluorescens ПИ ЛБХ-3, Pseudomonas putida ПИ ЛБХ-8, Xanthomonas species ПИ ЛБХ-7. В качестве минеральных добавок используют источники азота, фосфора, калия. В качестве наполнителя используют стерильный торф. Недостатком биопрепарата является сложный (мезофильные и психрофильные штаммы бактерий) состав микроорганизмов.

Основной задачей авторов настоящего изобретения было получение биопрепарата, обладающего высокой деструктивной способностью к утилизации трудноокисляемых фракций нефти и нефтепродуктов, стойкого при хранении, нетоксичного, неканцерогенного, не образующего при контакте с воздухом и водой токсичных и пожароопасных соединений.

Чистые культуры, входящие в заявляемый биопрепарат, выделены из нефтезагрязненных почв. Штаммы задепонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ФГУП ГосНИИгенетики.

Штамм Acidovorax delafieldii НТ-1 (ВКПМ В-8358) - подвижные с полярным жгутикованием прямые палочки размером 0,6-0,8×2,0 мкм, расположенные одиночно и попарно. Окраска по Граму - отрицательная. На стандартных питательных средах образует круглые колонии 2 мм в диаметре. Выпуклые, гладкие, блестящие, края ровные, бесцветные, непрозрачные. Аэроб, хемоорганотроф. Не нуждается в факторах роста. Оксидазный тест положительный. Каталазный тест положительный. Не образует флуоресцирующий пигмент. Растет при 4°С, не растет при 41°С. Не обладает способностью к денитрификации. Желатин не гидролизует. Крахмал не гидролизует. Использует в качестве единственного источника углерода глюкозу, глутамат, ксилозу, рибозу, малонат, углеводороды. Не использует трегалозу, инозит, рамнозу и сахарозу.

Штамм Burkholderia caryophylli НТ-4 (ВКПМ В-8359) - подвижные прямые палочки размером 0,8-0,9×0,9-2,0; 1,5×1,5 мкм, расположенные одиночно и скоплениями. Окраска по Граму - отрицательная. На стандартных питательных средах образует круглые колонии 2 мм в диаметре. Выпуклые, гладкие, блестящие, края ровные, белые, непрозрачные. Аэроб, хемоорганотроф. Не нуждается в факторах роста. Оксидазный тест положительный. Каталазный тест положительный. Не образует флуоресцирующий пигмент. Не растет при 4°С, растет при 41°С. Обладает способностью к денитрификации с образованием азота. Желатин не гидролизует. Крахмал не гидролизует. Использует в качестве единственного источника углерода глюкозу, глутамат, этанол, сукцинат, ксилозу, маннит, углеводороды.

Штамм Pseudomonas fluorescens biovar II НТ-6 (ВКПМ В-8360) - палочки прямые, мелкие, одиночные, слегка изогнутые, имеют полярные жгутики, споры не образует, размеры 0,8-0,9×1,1-3,0 мкм. Окраска по Граму - отрицательная. На стандартных средах образует круглые колонии диаметром 2 мм и более, выпуклые, гладкие, блестящие, края ровные, бесцветные, непрозрачные. Аэроб, способен расти в анаэробных условиях в присутствии в среде нитратов. Хемоорганотроф. Окислительный тип метаболизма. Растет при 4°С, не растет при 41°С. Штамм каталазо-положителен, оксидазо-положителен. Образует флуоресцирующий пигмент. Образует аргинин дегидролазу. Гидролизует желатину. Образует леван из сахарозы. Не гидролизует крахмал. Способен к денитрификации. Использует в качестве источника роста глюкозу, трегалозу, аргинин, инозит, углеводороды.

Штамм Cifrobacter amalonaticus Ян-3-2 (ВКПМ В-8361) - палочки прямые с закругленными концами, одиночно- и парнолежащие, размер 0,7-0,8×1,2-2,0 мкм. Окраска по Граму - отрицательная. Колонии на питательном агаре круглые, выпуклые с возвышением в центре, 3-5 мм в диаметре, гладкие, блестящие, края ровные, полупрозрачные, непигментированные. Метаболизм ферментативный. Штамм каталазо-положительный, оксидазо-отрицательный. Факультативный анаэроб. Обладает орнитин дегидролазой, но не лизин и аргинин. Не утилизирует цитрат и мочевину. Не образует сероводород. Образует индол. Реакция Фогес-Проскауера отрицательная. Не разжижает желатин. Образует кислоту из глюкозы, маннита, сорбита, рамнозы, амигдалина, арабинозы. Не образует кислоту из инозита, сахарозы и мелибиозы.

Штамм Pseudomonas fluorescens Ян-8-2 (ВКПМ В-8362) - палочки подвижные прямые с закругленными концами, одиночно и парно лежащие, размер 0,7-0,8×2,5-3,5 мкм. Окраска по Граму - отрицательная. Колонии на питательном агаре круглые, выпуклые 2-3 мм в диаметре, гладкие, блестящие, край мелкозубчатый, полупрозрачные, непигментированные. Метаболизм окислительный. Штамм каталазо-положительный, оксидазо-положительный. Аэроб, способен расти в анаэробных условиях, используя в качестве конечного акцептора электронов нитрат. Обладает денитрификацией, не нуждается в факторах роста. Растет при 4°С, не растет при 41°С. Обладает орнитин дегидролазой, но не лизин и аргинин. Утилизирует цитрат. Не разрушает мочевину. Не образует сероводород. Образует индол. Реакция Фогес-Проскауера отрицательная. Не разжижает желатин. Образует кислоту из глюкозы, маннита, сорбита, рамнозы, амигдалина, арабинозы. Не образует кислоту из инозита, сахарозы и мелибиозы.

Штамм Serratia marcescens Ян-10-2 (ВКПМ В-8363) - палочки прямые, размер 0,8-0,9×1,2-2,4 мкм. Окраска по Граму - отрицательная. Колонии на питательном агаре круглые, выпуклые, 3-5 мм в диаметре, гладкие, блестящие, края изрезанные, непрозрачные, красного цвета. Метаболизм ферментативный. Штамм каталазо-положительный, оксидазо-отрицательный. Факультативный анаэроб. Обладает орнитин и лизин, но не аргинин дегидролазой. Утилизирует цитрат. Не разрушает мочевину. Не образует сероводород. Реакция Фогес-Проскауера положительная. Обладает желатиназой. Образует кислоту из глюкозы, сахарозы, маннита, инозита, сорбита, амигдалина. Не образует из мелибиозы, рамнозы. Обладает нитрат редукцией.

Для получения препарата проводили раздельное культивирование штаммов по стандартной методике.

Полученные препараты после добавления консервантов хранили в холодильнике при температуре 4-6°С.

Непосредственно перед проведением испытаний шесть препаратов, каждый из которых содержал по одному штамму микроорганизма-деструктора, смешивали в одинаковых количествах.

Биопрепарат проходил испытания на модельных установках и производственных условиях.

Результаты проведения опытов на модельных установках с целью определения деструктивной способности биопрепарата приведены в таблице 1.

В первом опыте в пластмассовые сосуды объемом 1 л поместили по 500 г почвы, загрязненной мазутом. По данным хроматомасс-спектрометрического анализа содержание трудноокисляемых тяжелых фракций составляло 78%. В почву внесли по 10 мл лабораторного образца биопрепарата, предварительно разведенного водопроводной водой в 10 раз. В качестве источников азота, фосфора и калия внесли расчетное количество мочевины, двойного суперфосфата и хлорида калия; в качестве ПАВ использовали ТВИН-80. Почву в сосудах периодически увлажняли, не допуская пересыхания, перемешивая через день. В контрольных сосудах почву ничем не обрабатывали. Не увлажняли, не перемешивали.

Во втором опыте (условия аналогичны условиям опыта 1) использовали почву, загрязненную углеводородами с содержанием легких фракций 70-90%, а также тяжелыми металлами в концентрациях, в 10-50 раз превышающих предельно допустимые концентрации. Исходная концентрация углеводородов - 21,5 г/кг.

Таблица 1
Вариант опытаОбразецКонцентрация углеводородов, г/кгСредняя концентрация углеводородов, г/кгСнижение концентрации углеводородов, %
1Даты09.0129.0113.0202.0323.0309.0129.0113.0202.0323.0309.0129.0113.0202.0323.03
Исходная почва29,930.0
30,0
Контроль28,827,230,422,024,8
26,423,219,621,616,427,625,225,021,820,68,016,016,727,331,3
27,827,825,121,920,7
Биопрепарат12,09,27,26,85,614,610,07,06,45,451,366,076,787,782,0
17,211,26,86,05,2
2Даты31.0113.0202.0323.0325.0431.0113.0202.0323.0325.0431.0113.0202.0323.0325.04
Исходная почва18,821,5
25,0
Контроль18,814,410,010,410,219,215,612,010,310,010,727,444,252,150,0
19,616,814,010,29,8
Биопрепарат7,610,010,08,43,18,29,610,88,02,861,955,349,862,886,0
8,89,211,67,62,5

Биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, включающий консорциум аэробных бактериальных культур, отличающийся тем, что в качестве консорциума бактериальных культур используют Acidovorax delafieldii ВКПМ В-8358 (НТ-1), Burkholderia caryophylli ВКПМ В-8359 (НТ-4), Pseudomonas fluorescens biovar ВКПМ В-8360 (II НТ-6), Citrobacter amalonaticus ВКПМ В-8361 (Ян-3-2), Pseudomonas fluorescens ВКПМ В-8362 (Ян-8-2), Serratia marcescens ВКПМ В-8363 (Ян-10-2) с титром живых клеток не менее 1010.

www.findpatent.ru

Биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов

Изобретение относится к биотехнологии. Биопрепарат включает аэробные нефтеокисляющие микроорганизмы, минеральный питательный субстрат, нормальные парафины C12-C18 и твердый субстрат-носитель. В качестве аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов он содержит ассоциацию представителей 4 родов и 8 видов: Bacillus cereus, В. subtilis, Actinomyces griseus, Act. glaucus, Pseudomonas fluorescens, Ps. mesentericus, Ps. denitrificans, Arthrobacter globiformis, выделенных из нефти Советского месторождения Западной Сибири в концентрации 2,5×109 кл/г. В качестве субстрата-носителя содержит сферозолу и дополнительно содержит глюкозу. Изобретение позволяет производить высокоэффективную очистку. 4 табл., 4 ил.

 

Изобретение относится к нефтяной промышленности, сельскому хозяйству и экологии и может быть использовано для биологической очистки нефтезагрязненных почв и поверхности водных акваторий.

Нефть и нефтепродукты являются одним из основных источников загрязнения окружающей среды. Во всем мире ведутся интенсивные исследования по изучению влияния нефтезагрязнений на живую природу и поиску способов ускорения деструкции нефти, загрязняющей почву и воду. Установлено, что микроорганизмы катализируют ферментативное разложение нефти и нефтепродуктов, что может быть использовано для разработки биопрепаратов для очистки нефтезагрязненных почв и воды.

Следует отметить, что процесс деструкции углеводородов (УВ) нефти осуществляется микроорганизмами, однако практическая значимость микробной деградации в конечном итоге определяется составом биопрепарата, который обеспечивает жизнеспособность бактерий, их активность, а также технологичность изготовления, хранения, транспортировки и использования.

Известен бактериальный препарат "Путидойл", предназначенный для ускорения разложения нефти [А.С. SU 1076446, кл. С02F 3/34, 1984]. Технология изготовления биопрепарата предусматривает распылительную сушку живой культуры бактерий, что вызывает травмирование микробов и, как следствие, их частичную гибель и потерю необходимой активности. Для восстановления жизнедеятельности бактерий авторы применяют сложный комплекс мер: подогрев большого количества воды (5 м3) до 18-28°С, перемешивание, аэрирование, и все это в течение длительного времени (16-24 ч), что в полевых условиях выполнить довольно сложно.

Известен бактериальный препарат, состоящий из высокоактивных живых аэробных нефтеокисляющих бактерий (Mycobacterium, Pseudomonas и др.), выращенных на твердых субстратах-носителях с титрами 2,5-7,0·109 клет./г. В качестве субстрата-носителя для иммобилизации микроорганизмов используют гамма-стерильный торф с рН 6,8-7,0 в количестве 40-45 мас.% и воду в количестве 58,95-53,25 мас.%. С целью поддержания нефтеокисляющей активности в процессе хранения в препарат дополнительно вводят питательные субстраты: аммоний щавелевокислый (0,05-1,0 мас.%) и нормальные парафины (1,0-1,5 мас.%). Срок годности биопрепарата - 6 месяцев при температуре 10-15°С с момента его изготовления (патент РФ №2053205, МПК С02F 3/34). Биопрепарат содержит нефтеокисляющие бактерии, для поддержания жизнедеятельности которых требуется рН среды 6.8-7.0 и большое количество воды (около 60% воды), что снижает его эффективность во времени, увеличивает транспортные расходы, а кроме этого биопрепараты на основе торфа тонут в воде, что также понижает эффективность их действия, особенно при очистке нефтезагрязненной поверхности открытых водоемов. Существенным недостатком известного биопрепарата, значительно ограничивающим область его применения, также является возможность использования его только в узком диапазоне рН среды (рН 6.8-7.0).

Задачей изобретения является создание высокоэффективного сухого бактериального препарата на основе твердого субстрата-носителя, минерального питательного субстрата и протектора, обеспечивающего жизнеспособность сорбированной бактериальной углеводородокисляющей микрофлоры с высокой деструктивной активностью в широком диапазоне рН среды, а также увеличение срока годности и технологичности.

Технический результат достигается созданием биопрепарата для биологической очистки нефтезагрязненных экосистем, компонентами которого являются: сферозола (отходы угольных электростанций) как сорбент-носитель, иммобилизованная на ее поверхности биомасса углеводородокисляющих микроорганизмов, выделенных из нефти и протектор - глюкоза.

Биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, включающий аэробные нефтеокисляющие микроорганизмы, минеральный питательный субстрат, нормальные парафины от С12 до C16 и твердый субстрат-носитель, отличается тем, что в качестве аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов он содержит ассоциации Bacillus cereus, В. subtilis; Actinomyces griseus, Act. glaucus; Pseudomonas fluorescens, Ps. mesentericus, Ps. denitrificans; Arthrobacter globiformis, выделенные из нефти Советского месторождения Западной Сибири в концентрации 2.5×l09 клeт./г, в качестве субстрата-носителя содержит сферозолу и дополнительно содержит глюкозу при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Минеральный питательный субстрат - 0.85-0.95;

Нормальные парафины C12-C16 - 0.6-0.7;

Глюкоза - 0.9-1.0;

Ассоциация аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов - 0.06-0.08;

Сферозола - до 100.

В качестве твердого субстрата-носителя используется сферозола (отходы теплоэлектростанций), представляющая собой полые стеклокристаллические алюмосиликатные микросферы в составе летучей золы, образуемой при высокотемпературном сжигании углей на теплоэлекторостанциях. Физические свойства сферозолы приведены в таблице 1.

Совокупность уникальных свойств сферозолы: низкая плотность (меньше воды), малые размеры, сферическая форма, большая удельная поверхность, высокая твердость и температура плавления, химическая инертность, свободная растекаемость (сыпучесть) позволяют получить на ее основе эффективный, легкий, сыпучий биопрепарат, который не тонет в воде и не загрязняет окружающую среду. Попадая в загрязненную почву, сферозола способствует ее структурированию, повышает доступ кислорода для почвенной микрофлоры, что стимулирует ее окислительные процессы.

Минеральный питательный субстрат биопрепарата состоит из компонентов следующего состава, г: Nа2СО3 - 0.1, MgSO4 - 0.2, MnSO4·5h3O - 0.02, KН2РO4 - 0.5, Na2HPO4 - 0.7, CuCl·6h3O - 0.01, Nh5Cl - 2.0, NaCl - 2.0.

В качестве аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов биопрепарат содержит ассоциацию углеводородокисляющих микроорганизмов в концентрации не менее

2.5×l09 клeт./г. Ассоциация микроорганизмов выделена из нефти Советского месторождения Западной Сибири и включает представителей 4 родов и 8 видов.

1. Род Bacillus. Виды: B. cereus, B. subtilis - спорообразующие, высокоустойчивые к неблагоприятным условиям бактерии. Аэробы, хемоорганотрофы. Оксидазо- и каталазоположительные. При окислении углеводородов нефти активно образуют биоПАВ и другие продукты метаболизма.

2. Род Actinomyces. Виды: Act. griseus. Act. glaucus - относятся к классу лучистых грибков и имеют характерное строение, спорообразующие, усваивают минеральные соединения, сахара и углеводороды. Каталазоположительные, широко распространены в почве и воде. Утилизируют ароматические и насыщенные углеводороды.

3. Род Pseudomonas. Виды: Ps. fluorescens, Ps. mesentericus, Ps. denitrificans - спор не образуют. Аэробы. Оксидазо- и каталазоположительные, широко распространены в загрязненных почвах, подземных водах и открытых водоемах. Активно утилизируют широкий спектр углеводородов, в том числе ароматические.

4. Род Arthrobacter. Виды: Arth. globiformis - спор не образуют. Аэробы. Оксидазо- и каталазоположительные. Входят в состав физиологической группы углеводородокисляющих микроорганизмов, активно утилизируют ациклические насыщенные и полиароматические углеводороды. Устойчивы к неблагоприятным условиям. Широко распространены в загрязненных почве и воде.

Каждый вид микроорганизмов предпочтительно окисляет углеводороды определенного строения. В ассоциации они наиболее полно способны к деструкции загрязняющих нефтей и нефтепродуктов. Отбор штаммов, входящих в состав ассоциации, проводили на основании их способности к утилизации углеводородов при культивировании в контакте с нефтью в широком диапазоне рН, что выражалось в увеличении динамики роста и активности ферментов, катализирующих окислительные процессы.

Пример 1. Инкубацию культуры Bacillus cereus с определенным исходным числом клеток проводят в колбах Эрленмейера емкостью 500 мл, содержащих 100 мл минеральной среды и нефти (0.5% от объема среды). Вместо нефти можно использовать любой из жидких н-алканов от С12 до C16. В качестве минеральной среды применяют раствор минерального субстрата следующего состава, г/дм3: Nа2СО3 - 0.1, MgSO4 - 0.2, MnSO4·5h3O - 0.02, Kh3PO4 - 0.5, Na2HPO4 - 0.7, CuCl·6h3O - 0.01, Nh5Cl - 2.0, NaCl - 2.0. Поскольку процесс деструкции углеводородов нефти микроорганизмами протекает в присутствии кислорода, колбы с содержимым помещают на баню-качалку для перемешивания. Продолжительность инкубации нефти в контакте с микроорганизмами - 5 суток при постоянной температуре 27°С. Ежедневно проводят посев культуры на агаровые среды для определения динамики численности микроорганизмов. На 5-е сутки культивирования их число увеличилось в 100 раз от 0.035 до 3.5 млн клет./мл, что свидетельствует об использовании углеводородов нефти - единственного углеводного источника питания и энергии. Способность чистых культур к биодеструкции углеводородов оценивают также по увеличению активности каталазы и дегидрогеназы - ферментов оксигеназной группы, характеризующих биологическую активность микроорганизмов в нефтезагрязненной среде. Активность каталазы при этом возрастает от 0.21 до 0.43 мл/мл, дегидрогеназы - от 0.63 до 1.3 мг/мл. Накопленные ферменты становятся стабильными катализаторами окисления загрязняющих углеводородов.

Пример 2. Определение углеводородокисляющих свойств культуры Bacillus subtilis с исходной численностью 0.0328 млн клет./мл проводят по схеме, изложенной выше (пример 1). На 5-е сутки число клеток увеличилось до 4.2 млн клет./мл, активность каталазы при этом возрастает от 0.18 до 0.40 мл/мл, дегидрогеназы - от 0.50 до 1.02 мг/мл, что подтверждает оксигеназную активность культуры Bacillus subtilis.

Пример 3. Углеводородокисляющие свойства культуры Actinomyces griseus определяют по схеме, приведенной в примере 1. Исходная численность микроорганизмов составляет 0.05 млн клет./мл. На 5-е сутки численность увеличилась до 4.14 млн клет./мл, активность каталазы - от 0.23 до 0.40 мл/мл, дегидрогеназы - от 0.6 до 1.36 мг/мл, что свидетельствует об окислительной активности Act. griseus при культивировании в контакте с нефтью.

Пример 4. Углеводородокисляющие свойства культуры клеток Actinomyces glaucus определют по схеме, приведенной в примере 1. Исходная численность микроорганизмов составляет 0.043 млн клет./мл. На 5-е сутки численность увеличилась до 3.28 млн клет./мл, активность каталазы - от 0.20 до 0.38 мл/мл, дегидрогеназы - от 0.55 до 1.09 мг/мл, что подтверждает способность Act. glaucus к утилизации углеводородов нефти.

Пример 5. Углеводородокисляющие свойства культуры клеток Pseudomonas fluorescens определяют по схеме, приведенной в примере 1. Исходная численность микроорганизмов составляет 0.025 млн клет./мл. На 5-е сутки численность увеличилась до 3.14 млн клет./мл, активность каталазы - от 0.18 до 0.42 мл/мл, дегидрогеназы - от 0.6 до 1.36 мг/мл, что свидетельствует об окислительной активности культуры при деструкции нефти.

Пример 6. Углеводородокисляющие свойства культуры клеток Pseudomonas mesentericus определяют по схеме, приведенной в примере 1. Исходная численность микроорганизмов составляет 0.064 млн клет./мл. На 5-е сутки численность увеличилась до 7.19 млн клет./мл, активность каталазы - от 0.29 до 0.63 мл/мл, дегидрогеназы - от 0.6 до 1.36 мг/мл, что свидетельствует о высокой способности культуры Ps. mesentericus к утилизации нефти.

Пример 7. Углеводородокисляющие свойства культуры клеток Pseudomonas denitrificans определяют по схеме, приведенной в примере 1. Исходная численность микроорганизмов составляет 0.052 млн клет./мл. На 5-е сутки численность увеличилась до 5.8 млн клет./мл, активность каталазы - от 0.24 до 0.5 мл/мл, дегидрогеназы - от 0.48 до 1.03 мг/мл, что свидетельствует об окислительной активности культуры Ps. denitrificans.

Пример 8. Углеводородокисляющие свойства культуры клеток Arthrobacter globiformis определяют по схеме, приведенной в примере 1. Исходная численность микроорганизмов составляет 0.0216 млн клет./мл. На 5-е сутки численность увеличилась до 3.79 млн клет./мл, активность каталазы - от 0.18 до 0.4 мл/мл, дегидрогеназы - от 0.6 до 1.5 мг/мл почвы, что свидетельствует о высокой активности ферментов оксигеназной группы культуры Arth. globiformis при деструкции нефти.

Сорбционную активность углеводородокисляющих микроорганизмов на поверхности сферозолы изучали в модельных экспериментах в статических (таблица 2) и динамических (таблица 3) условиях в сравнении с известным сорбентом силикагелем марки L 40/100 Чешского производства.

Из результатов, представленных в таблице 2, следует, что сорбционная активность микроорганизмов на поверхности сферозолы при значениях рН среды 3.4, 7.2 и 9.5 сравнима с известным дорогостоящим сорбентом - силикагелем, а из результатов, представленных в таблице 3, следует, что сорбционная активность микроорганизмов при фильтрации через слой сферозолы также не уступает сорбционной активности известного сорбента.

С целью поддержания жизнеспособности и каталитической активности углеводородокисляющих микроорганизмов, сорбированных на поверхности сферозолы, биопрепарат содержит питательный минеральный субстрат, нормальные парафины и в качестве протектора, обеспечивающего жизнеспособность клеток в сухом биопрепарате, - глюкозу. Биопрепарат готовят следующим образом.

Пример 9. Для накопления биомассы углеводородокисляющих микроорганизмов в ферментер объемом 50 дм3 вносят 25 дм3 водного раствора минерального субстрата, играющего роль питательной среды, следующего состава, г/дм3:

Nа2СО3 - 0.1

MgSO4 - 0.2

MnSO4·5h3O - 0.02

Kh3PO4 - 0.5

Na2HPO4 - 0.7

CuCl·6h3O - 0.01

Nh5Cl - 2.0

NaCl - 2.0.

Среда инокулируется ассоциацией микроорганизмов, выделенных из нефти Советского месторождения Западной Сибири и включающих представителей 4 родов, 8 видов. Исходная концентрация микроорганизмов в ферментере 8×106 клет./мл. Затем в ферментер вносят 15 кг сферозолы и добавляют 150 г глюкозы и 100 г гексадекана (nC16) или другого углеводорода (н-алкана) как источника энергии и дополнительного углеродного субстрата для микробных клеток. Их размножение в ферментере и сорбция на поверхности сферозолы происходит при температуре 25-27°С в течение 5 суток при постоянном перемешивании, что обеспечивает дополнительный приток кислорода. Затем сферозолу с иммобилизованной микрофлорой отделяют от жидкой фазы, высушивают на воздухе и пакетируют в бумажные мешки по 5 кг. Концентрация клеток в 1 г готового биопрепарата 2.5×109, влажность препарата 3-5 мас.%, срок годности 1 год.

Полученный препарат был испытан в модельных экспериментах по очистке нефтезагрязненных воды и почвы.

Концентрация нефти в почве составила 5 мас.%, в воде - 3 мас.%. Препарат вносили в концентрации 1.0 г/кг. На протяжении эксперимента (30 суток) определяли динамику численности микроорганизмов, максимум которых в нефтезагрязненной почве на 10-12 сутки составляет 7.15×109 клет./г, в воде - 12.3×109 клет./см3 (табл.4). Динамика роста согласуется с деструктивной активностью микроорганизмов. В конце эксперимента остаточная нефть методом экстракции хлороформом была извлечена из почвы и воды. Биодеградация нефти в почве за 30 суток составила 75% (37.5 г), в воде - 90% (27 г). Результаты лабораторных экспериментов на модели воды и почвы, загрязненных нефтью, представлены в таблице 4.

Изменения молекулярно-массового распределения ациклических насыщенных углеводородов (н-алканов) нефти, биодеградированной в условиях водной фазы и почвы, представлены в сравнении с исходной нефтью (фиг.1, 2). Пробы анализировали методом газожидкостной хроматографии. Коэффициент биодеградации н-алканов загрязняющей нефти, определяемый по формуле (Pr+Ph)/(nC17+nC18), для почвы равен 6.0, для воды - 6.5, для исходного загрязнения этот показатель не превышает 0.6.

Результаты модельных экспериментов однозначно показывают, что применение предлагаемого биопрепарата на 30-е сутки существенно снижает уровень нефтезагрязнения воды и почвы на 90 и 75% соответственно.

Таблица 1
Физические свойства сферозолы
Форма сферическая
Цвет серо-белый
Истинная плотность 0.6-0.8 г/см3
Размер частиц 10-150 микрон
Насыпная плотность 0.40 г/см3
Удельная поверхность 7.0 м2/г
Температура плавления 1300°С
рН в воде 6-8
Поверхностная влажность 0,3% мас.

Таблица 3
Сорбция микробных клеток рода Micrococcus в динамических условиях фильтрации через колонки, заполненные сорбентами при рН среды 7,0
Изучаемые тесты Исходное число микробов
300 млн клет. 180 млн клет.
Сорбенты
Сферозола Силикагель Сферозола Силикагель
Высота сорбента в колонке, см 15.5 9.5 20.5 20
Вес сорбента, г 2.5 2.5 2.5 2.5
Объем микробной взвеси для фильтрации, мл 10 10 10 10
Скорость фильтрации, мл/мин 0.13 0.15 0.12 0.14
Общее число клеток в микробной взвеси после фильтр., млн клет. 5.3 4.83 5.9 0.28
Общее число сорбированных клеток, млн клет. 294.7 295.17 174.1 179.72
Сорбция клеток на 1 г сорбента, млн клет./г 117.88 118.07 69.64 71.89

Биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, включающий аэробные нефтеокисляющие микроорганизмы, минеральный питательный субстрат, нормальные парафины от С12 до C18 и твердый субстрат-носитель, отличающийся тем, что в качестве аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов он содержит ассоциацию представителей 4-х родов и 8 видов: Bacillus cereus, В. subtilis, Actinomyces griseus, Act. glaucus, Pseudomonas fluorescens, Ps. mesentericus, Ps. denitrificans, Arthrobacter globiformis, выделенных из нефти Советского месторождения Западной Сибири в концентрации 2,5·109 кл/г, в качестве субстрата-носителя содержит сферозолу и дополнительно содержит глюкозу при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Минеральный питательный субстрат 0,85-0,95
Нормальные парафины C12-C18 0,6-0,7
Глюкоза 0,9-1,0
Ассоциация аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов 0,06-0,08
Сферозола До 100.

www.findpatent.ru